Данное исследование направлено на создание эффективного протокола для сохранения содержимого дыхательных путей мышей в моделях легочной инфекции. Мы разрабатываем возможность ответить на вопрос о том, где вдыхаемые грибковые споры попадают в легкие. В последнее время многие группы определили роль различных эпителиальных клеток дыхательных путей в восприятии инфекций и инициировании защитных иммунных реакций.
Эти эпителиальные клетки варьируются от булавовидных клеток в бронхах до эпителиальных клеток типа II в терминальных альвеолах. Распространенный метод подготовки легких заключается в надувании легкого жидким фиксатором для сохранения легочной ткани для последующего гистологического анализа. Однако этот метод вытесняет содержимое дыхательных путей, например, вдыхаемые споры грибов.
Наш протокол сохраняет естественное расположение вдыхаемых грибковых спор в легких, сохраняя при этом правильную морфологию легких за счет надувания воздуха и правильную фиксацию легких с помощью сосудистой перфузии. Мы надеемся использовать этот протокол для характеристики бронхоальвеолярных соединений, в которых, по-видимому, приземляются споры в нашей модели, но мы будем использовать расположение спор в непосредственной близости от различных эпителиальных клеток и изучать результирующие иммунные реакции. Для начала окрасьте один раз по 10 в степени шести спор Coccidioides posadasii пятью микромолярами CFSE в течение 30 минут при температуре 30 градусов Цельсия.
После окрашивания промойте споры PBS. Центрифугируйте споры в дозе 12 000 г и повторно суспендируйте гранулу в 25 микролитрах PBS для спорового инокулята в соответствующей концентрации. Приготовьте пипетку с 25 микролитрами спорового инокулюма.
После обезболивания мыши в баночке Nalgene расположите мышь в положении лежа на спине в одной руке и дайте ей сделать от трех до пяти регулярных задыхающихся вдохов. Поместите наконечник пипетки в заднюю часть ротоглотки мыши и выпустите инокулюм во время вдоха. Прощупайте хрипы на задней и передней частях грудной клетки мыши рукой и большим пальцем, чтобы подтвердить вдыхание инокулята.
Опрыскайте мышь, находящуюся под глубоким наркозом, 70% этанола. С помощью ножниц аккуратно отрежьте кожу мыши, затем раздвиньте ее, чтобы обнажить брюшину. Затем натяните кожу с верхней половины на голову мыши, освобождая руки.
Теперь разрежьте перитонеальную оболочку у грудины и вдоль нижней части грудной клетки, обнажив брюшину. Сместите печень вниз, чтобы раскрыть диафрагму. С помощью ножниц осторожно проколите диафрагму в сторону от паренхимы легкого.
Далее разрежьте грудную клетку с левой стороны, чтобы обнажить сердце. С помощью иглы 30-го калибра введите от 5 до 10 миллилитров PBS в правый желудочек. После извлечения иглы с помощью новой иглы введите пять миллилитров 10% нейтрального буферизованного формалина в правый желудочек.
С помощью ножниц удалите переднюю половину грудной клетки. Чтобы обнажить трахею, разрежьте верхние ребра и ключицы справа и слева от шеи, избегая средней линии, где лежит трахея. С помощью щипцов обхватите оставшиеся верхние ребра и ключицы возле средней линии шеи и тяните вверх, пока трахея не обнажится.
Подготовьте 10-сантиметровую шовную нить и протяните ее под трахею. Предварительно завяжите свободный узел на нижнем конце оголенной трахеи. Затем приготовьте одномиллилитровый шприц с воздухом с катетером 18-го калибра.
С помощью иглы 18-го калибра проделайте отверстие в трахее на верхнем конце открытой области. Теперь вставьте катетер в отверстие, обеспечив плотное прилегание и предотвращение выхода воздуха. Затем медленно вводите один миллилитр воздуха в легкие в течение 10 секунд, наблюдая за раздуванием всех долей легких.
Полное надувание приводит к тому, что легкие слегка оборачиваются вокруг сердца и заполняют объем, занимаемый в непроколотой диафрагме. Изолировав легкие от мыши, поместите ее на верхний край 50-миллилитровой конической трубки, заполненной 20 миллилитрами 10% нейтрального буферизованного формалина. Поместите нити шовной нити снаружи трубки, затем закрутите колпачок.
Для начала промойте изолированные легкие мыши в PBS и поместите их в 30% раствор сахарозы PBS на 72-96 часов при четырех градусах Цельсия. После этого удалите лишнюю ткань и поместите легкие в криомолд со средой ОКТ. Заморозьте образец при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Уравновесьте образец в криоблоках ОКТ при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение одного часа перед разделкой блоков толщиной от 20 до 100 микрометров. Соберите секции на предметное стекло и дайте им высохнуть от 30 минут до одного часа. Поместите предметное стекло в ванну PBS при комнатной температуре на 30 минут, чтобы удалить ОКТ из ткани.
Затем с помощью салфетки удалите лишние капли по периметру предметного стекла вокруг образца ткани. Нарисуйте периметр вокруг образца на предметном стекле с помощью гидрофобной ручки PAP и дайте ему высохнуть в течение пяти минут. Затем добавьте на предметное стекло 300 микролитров свежеприготовленного блокирующего раствора, не содержащего животных, и инкубируйте при комнатной температуре.
Теперь инкубируйте предметное стекло в 300 микролитрах первичного конъюгированного раствора антитела EpCAM против мышей Alexa Fluor 647 в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день удалите раствор антител и дважды промойте предметное стекло 300 микролитрами PBS в течение пяти минут. После высыхания добавьте по одной капле мягкого крепления стекла SlowFade комнатной температуры на каждый кусок ткани.
Наложите покровный стекло на ткань, убедившись, что он выходит за пределы образца и периметра гидрофобного маркера. Для начала поместите инокулированный, иммуноокрашенный срез легких мыши под многоканальный флуоресцентный микроскоп и выберите подходящий объектив. Чтобы захватить всю долю легкого, соберите достаточное количество фрагментов изображения и объедините их вместе.
Используя программное обеспечение микроскопа, экспортируйте изображение всей доли легкого для последующей обработки. В QuPath создайте файл проекта и добавьте в него флуоресцентные изображения. Классифицируйте EpCAM-положительные пиксели как эпителий, последовательно выбрав Классифицировать, Классификация пикселей и Создать пороговый уровень.
Выберите разрешение, канал, сигму сглаживания и пороговое значение, чтобы определить целевую область. Сохраните классификатор под уникальным именем и выберите Создать объекты. В новом окне "Создание объектов" выберите "Новый тип объекта" в качестве аннотации.
Для эпителия легких установите минимальный размер объекта и минимальный размер отверстия на 100 квадратных микрометров. После нажатия кнопки OK аннотации будут созданы, и их можно будет изменить с помощью инструмента кисти. Чтобы классифицировать споры, повторите шаги, как показано для аннотаций эпителия легких.
Затем в окне Создание объектов выберите Обнаружение в качестве нового типа объекта. Установите минимальный размер объекта и минимальный размер отверстия равным нулю квадратных микрометров и выберите Разделить объекты. Далее, чтобы провести последовательный пространственный анализ спор, выберите Анализ, Пространственный анализ и вычислите знаковое расстояние до аннотаций двумерно.
Расстояния до EpCAM-положительного эпителия будут рассчитаны для каждой обнаруженной споры. Наконец, нажмите «Измерить», а затем «Экспортировать измерения», чтобы экспортировать результаты. Споры Coccidioides posadasii накапливались в основном в дистальных отделах бронхов и близлежащих альвеолярных пространствах в надутых воздухом легких.
Споры оказались более рассеянными от бронхов в формальных и надутых жидкостью легких по сравнению с надутыми воздухом легкими. Расстояние между спорами и EpCAM-положительным бронхиолярным эпителием было больше в легких, надутых жидкостью, по сравнению с физиологическим надуванием воздуха, что указывает на более дисперсные споры.
