يهدف هذا البحث إلى إنشاء بروتوكول فعال للحفاظ على محتويات مجرى الهواء للفئران في نماذج عدوى الرئة. نحن نعمل على تطوير القدرة على الإجابة على سؤال حول مكان هبوط الجراثيم الفطرية المستنشقة في الرئتين. في الآونة الأخيرة ، حددت العديد من المجموعات أدوارا لمختلف الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في استشعار العدوى وبدء الاستجابات المناعية الوقائية.
تتراوح هذه الخلايا الظهارية من خلايا النادي في الشعب الهوائية إلى الخلايا الظهارية من النوع الثاني في الحويصلات الهوائية الطرفية. تتمثل تقنية تحضير الرئة الشائعة في تضخيم الرئة بالمثبت السائل للحفاظ على أنسجة الرئة للتحليلات النسيجية النهائية. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية تزيح محتويات الشعب الهوائية ، مثل الجراثيم الفطرية المستنشقة.
يحافظ بروتوكولنا على الموقع الطبيعي للجراثيم الفطرية المستنشقة في الرئة مع الحفاظ على مورفولوجيا الرئة المناسبة عن طريق نفخ الهواء وتثبيت الرئة المناسب من خلال تروية الأوعية الدموية. نأمل في استخدام هذا البروتوكول لتوصيف التقاطعات القصبية السنخية حيث يبدو أن الجراثيم تهبط في نموذجنا ، لكننا سنستخدم مواقع الجراثيم بالقرب من الخلايا الظهارية المختلفة وندرس الاستجابات المناعية الناتجة. للبدء ، قم بتلطيخ صبغ واحد في 10 أس ستة جراثيم Coccidioides posadasii بتركيز خمسة ميكرومولار من CFSE لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية.
بعد تلطيخ ، اغسل الجراثيم باستخدام PBS. الطرد المركزي للجراثيم عند 12 ، 000 جم وأعد تعليق الحبيبات في 25 ميكرولتر من PBS لتلقيح الأبواغ بالتركيز المناسب. تحضير ماصة تحتوي على 25 ميكرولتر من لقاح البوغ.
بعد تخدير الفأر في جرة نالجين ، ضع الفأر في وضع ضعيف بيد واحدة واتركه يأخذ ثلاثة إلى خمسة أنفاس شهقة منتظمة. ضع طرف الماصة في الجزء الخلفي من البلعوم الفموي للفأر وحرر اللقاح أثناء الاستنشاق. اشعر بخشخشة على الجوانب الخلفية والأمامية لصدر الفأر باليد والإبهام لتأكيد استنشاق اللقاح.
رش الفأر المخدر بعمق بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام المقص ، قم بقص جلد الماوس بعناية ، ثم اسحبه لفضح الصفاق. ثم اسحب الجلد من النصف العلوي فوق رأس الماوس ، وحرر الذراعين.
الآن ، قم بقطع الغشاء البريتوني عند القص وعلى طول الجانب السفلي من القفص الصدري ، مما يؤدي إلى تعريض الصفاق. إزاحة الكبد بشكل أدنى للكشف عن الحجاب الحاجز. استخدم المقص لثقب الحجاب الحاجز بعناية بعيدا عن حمة الرئة.
بعد ذلك ، قم بقطع القفص الصدري على الجانب الأيسر لفضح القلب. باستخدام إبرة قياس 30 ، قم بحقن خمسة إلى 10 ملليلتر من PBS في البطين الأيمن. بعد إزالة الإبرة ، استخدم إبرة جديدة لحقن خمسة ملليلتر من الفورمالين المحايد 10٪ في البطين الأيمن.
باستخدام المقص ، قم بإزالة النصف الأمامي من القفص الصدري. لفضح القصبة الهوائية ، قم بقص الأضلاع العلوية وعظام الترقوة على يمين ويسار الرقبة ، وتجنب خط الوسط حيث تقع القصبة الهوائية. باستخدام الملقط ، قم بإمساك الأضلاع العلوية وعظام الترقوة المتبقية بالقرب من خط الوسط للرقبة واسحبها بشكل متفوق حتى تنكشف القصبة الهوائية.
قم بإعداد خيط خياطة بطول 10 سم واسحبه تحت القصبة الهوائية. اربط عقدة فضفاضة مسبقا في الطرف السفلي من القصبة الهوائية المكشوفة. ثم قم بإعداد حقنة هواء سعة ملليلتر واحد بقسطرة قياس 18.
باستخدام إبرة قياس 18 ، قم بعمل ثقب في القصبة الهوائية في الطرف العلوي من المنطقة المكشوفة. الآن ، أدخل القسطرة في الفتحة ، مما يضمن ملاءمة محكمة لمنع الهواء من الهروب. بعد ذلك ، قم بحقن ملليلتر واحد من الهواء ببطء في الرئتين على مدى 10 ثوان ، مع مراقبة تضخم جميع فصوص الرئة.
ينتج عن التضخم الكامل الرئتين يلتف قليلا حول القلب ويملئان الحجم المشغول في الحجاب الحاجز غير المثقوب. بعد عزل الرئتين عن الماوس ، ضعه على الحافة العلوية لأنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مملوء ب 20 مل من الفورمالين المحايد بنسبة 10٪. ضع خيوط الخياطة خارج الأنبوب ، ثم قم بلف الغطاء.
للبدء ، اشطف رئتي الفأر المعزولات في PBS ، وضعها في محلول 30٪ سكروز PBS لمدة 72 إلى 96 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنسجة الزائدة وضع الرئتين في Cryomold مع وسيط OCT. قم بتجميد العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
قم بموازنة العينة في كتل التبريد OCT عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة قبل تقسيم الكتل بسماكة 20 إلى 100 ميكرومتر. اجمع الأقسام على شريحة زجاجية واتركها تجف لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. ضع الشريحة في حمام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لإزالة OCT من الأنسجة.
بعد ذلك ، استخدم منديلا لإزالة أي قطرات زائدة من محيط الشريحة حول عينة الأنسجة. ارسم محيطا حول العينة على الشريحة باستخدام قلم PAP مسعور واتركه يجف لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من محلول الحجب الخالي من المحضر حديثا على الشريحة واحتضنه في درجة حرارة الغرفة.
الآن ، احتضان الشريحة في 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة EpCAM المترافق للفئران Alexa Fluor 647 بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد واغسل الشريحة مرتين باستخدام 300 ميكرولتر من PBS لمدة خمس دقائق. بعد التجفيف ، أضف قطرة واحدة من وسط تركيب الزجاج SlowFade الناعم بدرجة حرارة الغرفة إلى كل قطعة من الأنسجة.
ضع غطاء على الأنسجة ، مع التأكد من امتداته إلى ما وراء العينة ومحيط العلامة الكارهة للماء. للبدء ، ضع قسم رئة الفأر الملقح بالأبواغ الفطرية تحت مجهر فلوري متعدد القنوات وحدد هدفا مناسبا. لالتقاط فص الرئة بالكامل ، اجمع مربعات صور كافية ودمجها معا.
باستخدام برنامج المجهر ، قم بتصدير صورة فص الرئة بالكامل للمعالجة النهائية. في QuPath ، قم بإنشاء ملف مشروع وأضف صور الفلورسنت إلى الملف. قم بتصنيف وحدات البكسل موجبة EpCAM على أنها ظهارة عن طريق تحديد Classify وتصنيف Pixel وCreate Thresholder بالتسلسل.
حدد الدقة والقناة والسيجما المتجانسة وقيمة العتبة لتحديد المنطقة المستهدفة. احفظ المصنف تحت اسم فريد وحدد إنشاء كائنات. في نافذة إنشاء كائنات الجديدة، حدد نوع كائن جديد كتعليق توضيحي.
بالنسبة لظهارة الرئة ، اضبط الحد الأدنى لحجم الجسم والحد الأدنى لحجم الثقب على 100 ميكرومتر مربع. بعد تحديد موافق ، سيتم إنشاء التعليقات التوضيحية ويمكن تعديلها باستخدام أداة الفرشاة. لتصنيف الجراثيم، كرر الخطوات كما هو موضح للتعليقات التوضيحية لظهارة الرئة.
بعد ذلك، من نافذة إنشاء كائنات، حدد اكتشاف كنوع كائن جديد. قم بتعيين الحد الأدنى لحجم الكائن والحد الأدنى لحجم الثقب إلى صفر ميكرومتر مربع وحدد تقسيم الكائنات. بعد ذلك ، لإجراء التحليل المكاني للجراثيم بالتتابع ، حدد التحليل والتحليل المكاني وحساب المسافة الموقعة للتعليقات التوضيحية ثنائية الأبعاد.
سيتم حساب المسافات إلى الظهارة موجبة EpCAM لكل بوغ تم اكتشافه. أخيرا ، انقر فوق قياس ، متبوعا بقياس التصدير لتصدير النتائج. تراكمت جراثيم Coccidioides posadasii بشكل أساسي في الشعب الهوائية البعيدة والمساحات السنخية القريبة في الرئتين المنتفخة بالهواء.
بدت الجراثيم أكثر تشتتا بعيدا عن الشعب الهوائية في الرئتين الرسمية والمنتفخة بالسائل مقارنة بالرئتين المنتفختين بالهواء. كانت المسافة بين الجراثيم وظهارة القصبات الهوائية الإيجابية ل EpCAM أكبر في الرئتين المنتفختين بالسائل مقارنة بتضخم الهواء الفسيولوجي ، مما يشير إلى المزيد من الجراثيم المشتتة.
