Esta pesquisa tem como objetivo estabelecer um protocolo eficiente para preservar o conteúdo das vias aéreas de camundongos em modelos de infecção pulmonar. Estamos desenvolvendo a capacidade de responder à pergunta de onde os esporos de fungos inalados pousam nos pulmões. Recentemente, muitos grupos identificaram papéis para várias células epiteliais das vias aéreas na detecção de infecções e no início de respostas imunes protetoras.
Essas células epiteliais variam de células de clube nos brônquios a células epiteliais tipo II nos alvéolos terminais. A técnica comum de preparação pulmonar é inflar o pulmão com o fixador líquido para preservar o tecido pulmonar para análises histológicas a jusante. No entanto, essa técnica desloca o conteúdo das vias aéreas, como esporos de fungos inalados.
Nosso protocolo preserva a localização natural dos esporos de fungos inalados no pulmão, mantendo a morfologia pulmonar adequada por meio de insuflação de ar e fixação pulmonar adequada por meio de perfusão vascular. Esperamos usar este protocolo para caracterizar as junções broncoalveolares onde os esporos parecem estar pousando em nosso modelo, mas utilizaremos as localizações dos esporos nas proximidades de várias células epiteliais e estudaremos as respostas imunes resultantes. Para começar, core uma vez 10 elevado a seis esporos de Coccidioides posadasii com cinco concentrações micromolares de CFSE por 30 minutos a 30 graus Celsius.
Após a coloração, lave os esporos com PBS. Centrifugar os esporos a 12 000 g e ressuspender o sedimento em 25 microlitros de PBS para o inóculo dos esporos à concentração adequada. Prepare uma pipeta com 25 microlitros do inóculo dos esporos.
Depois de anestesiar o camundongo em um frasco de Nalgene, posicione-o em decúbito dorsal com uma das mãos e deixe-o respirar de três a cinco respirações ofegantes regulares. Coloque a ponta da pipeta na parte posterior da orofaringe do camundongo e libere o inóculo durante a inalação. Sinta crepitações nos aspectos posterior e anterior do tórax do camundongo com a mão e o polegar para confirmar a inalação do inóculo.
Pulverize o camundongo profundamente anestesiado com 70% de etanol. Usando uma tesoura, corte cuidadosamente a pele do mouse e separe-a para expor o peritônio. Em seguida, puxe a pele da metade superior sobre a cabeça do rato, liberando os braços.
Agora, corte a membrana peritoneal no esterno e ao longo da face inferior da caixa torácica, expondo o peritônio. Desloque o fígado inferiormente para revelar o diafragma. Use uma tesoura para perfurar cuidadosamente o diafragma do parênquima pulmonar.
Em seguida, corte a caixa torácica do lado esquerdo para expor o coração. Usando uma agulha de calibre 30, injete de cinco a 10 mililitros de PBS no ventrículo direito. Depois de remover a agulha, use uma nova agulha para injetar cinco mililitros de formalina tamponada a 10% neutra no ventrículo direito.
Usando uma tesoura, remova a metade anterior da caixa torácica. Para expor a traqueia, corte as costelas superiores e as clavículas à direita e à esquerda do pescoço, evitando a linha média onde fica a traqueia. Usando uma pinça, prenda as costelas superiores e as clavículas restantes perto da linha média do pescoço e puxe superiormente até que a traqueia fique exposta.
Prepare um fio de sutura de 10 centímetros e puxe-o sob a traqueia. Pré-amarre um nó solto na extremidade inferior da traqueia exposta. Em seguida, prepare uma seringa de ar de um mililitro com um cateter de calibre 18.
Usando uma agulha de calibre 18, faça um orifício na traqueia na extremidade superior da região exposta. Agora, insira o cateter no orifício, garantindo um ajuste firme para evitar que o ar escape. Em seguida, injete lentamente um mililitro de ar nos pulmões durante 10 segundos, observando a inflação de todos os lobos pulmonares.
A inflação completa resulta nos pulmões envolvendo levemente o coração e preenchendo o volume ocupado no diafragma não perfurado. Depois de isolar os pulmões do camundongo, coloque-o na borda superior de um tubo cônico de 50 mililitros preenchido com 20 mililitros de formalina tamponada a 10% neutra. Coloque os fios de sutura fora do tubo e aperte a tampa.
Para começar, enxágue os pulmões isolados do camundongo em PBS e coloque-os em uma solução de PBS de sacarose a 30% por 72 a 96 horas a quatro graus Celsius. Depois, remova o excesso de tecido e coloque os pulmões em um meio Cryomold com OCT. Congele a amostra a menos 80 graus Celsius.
Equilibre a amostra em crioblocos OCT a menos 20 graus Celsius por uma hora antes de seccionar os blocos com 20 a 100 micrômetros de espessura. Colete as seções em uma lâmina de vidro e deixe-as secar por 30 minutos a uma hora. Coloque a lâmina em um banho PBS em temperatura ambiente por 30 minutos para remover a OCT do tecido.
Em seguida, use um lenço para remover qualquer excesso de gotículas do perímetro da lâmina ao redor da amostra de tecido. Desenhe um perímetro ao redor da amostra na lâmina usando uma caneta PAP hidrofóbica e deixe secar por cinco minutos. Em seguida, adicione 300 microlitros de solução de bloqueio sem animais recém-preparada na lâmina e incube em temperatura ambiente.
Agora, incube a lâmina em 300 microlitros de solução primária de anticorpo EpCAM de rato conjugado Alexa Fluor 647 durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova a solução de anticorpos e lave a lâmina duas vezes com 300 microlitros de PBS por cinco minutos. Após a secagem, adicione uma gota de meio de montagem de vidro SlowFade à temperatura ambiente em cada pedaço de tecido.
Coloque uma lamínula sobre o tecido, garantindo que ele se estenda além da amostra e do perímetro do marcador hidrofóbico. Para começar, coloque a seção de pulmão de camundongo inoculada e imunomarcada com esporos de fungos sob um microscópio fluorescente multicanal e selecione uma objetiva apropriada. Para capturar todo o lobo pulmonar, colete blocos de imagem suficientes e mescle-os.
Usando o software do microscópio, exporte a imagem de todo o lobo pulmonar para processamento a jusante. No QuPath, crie um arquivo de projeto e adicione as imagens fluorescentes ao arquivo. Classifique os pixels positivos para EpCAM como epitélio selecionando sequencialmente Classificar, Classificação de pixels e Criar limiar.
Selecione a resolução, o canal, o sigma de suavização e o valor limite para identificar a região de destino. Salve o classificador com um nome exclusivo e selecione Criar objetos. Na nova janela Criar objetos, selecione Novo tipo de objeto como Anotação.
Para epitélio pulmonar, defina o tamanho mínimo do objeto e o tamanho mínimo do orifício para 100 micrômetros quadrados. Depois de selecionar OK, as anotações serão criadas e podem ser modificadas usando a ferramenta pincel. Para classificar os esporos, repita as etapas conforme demonstrado para anotações do epitélio pulmonar.
Em seguida, na janela Criar objetos, selecione Detecção como o novo tipo de objeto. Defina o tamanho mínimo do objeto e o tamanho mínimo do furo como zero micrômetros quadrados e selecione Dividir objetos. Em seguida, para realizar a análise espacial dos esporos sequencialmente, selecione Analisar, Análise espacial e calcular a distância sinalizada para anotações bidimensionais.
As distâncias até o epitélio positivo para EpCAM serão calculadas para cada esporo detectado. Por fim, clique em Medir, seguido de Exportar medidas para exportar os resultados. Os esporos de Coccidioides posadasii se acumularam principalmente nos brônquios distais e nos espaços alveolares próximos nos pulmões inflados com ar.
Os esporos pareciam mais dispersos longe dos brônquios em pulmões formais e inflados com líquido em comparação com pulmões inflados com ar. A distância entre os esporos e o epitélio bronquiolar positivo para EpCAM foi maior nos pulmões inflados com líquido em comparação com a insuflação fisiológica do ar, indicando esporos mais dispersos.
