Секретум фильтрата культуры Mtb дает представление о факторах вирулентности или других белках, выделяемых патогеном для терапевтических вмешательств. Здесь мы пытаемся выяснить секретируемые бактериями белки, которые могли бы дать представление о системе секреции Mtb, его неизвестных факторах вирулентности и их влиянии на модуляцию хозяина для выживания патогена внутри хозяина. В области исследований МТБ такие препараты, как бедаквилин, деламанид, могут использоваться для лечения МЛУ и наружных штаммов.
До сих пор продолжаются исследования по разработке препаратов по МЛУ и ШЛУ, а также вакцин против МБТ. Мтб все больше приобретает устойчивость из-за несоблюдения схем приема лекарств. Лечение штаммов MDR, XDR является наиболее сложной задачей в области исследований МТБ.
Наша группа сделала множество важных открытий в этой области. Наша лаборатория показала влияние фосфорилирования CFP-10 на вирулентность Mtb и установила фосфо-протеом, фосфо-секретум и секретумную сеть Mtb. Кроме того, статья из лаборатории показала, что секретор SecA2 опосредует повреждение ДНК в организме хозяина.
Обработка клеток белками, отфильтрованными в культуре, вместо бактерий изменяет уровень цитокинов и других иммуномодулирующих факторов. С помощью исследования секрета можно выявить новые вирулентные факторы и их роль в вирулентности. Для начала удалите четыре независимых стебля глицерина Mtb при температуре минус 80 градусов Цельсия и разморозьте их при комнатной температуре.
В 100-миллилитровую автоклавную коническую колбу с завинчивающейся крышкой налейте 10 миллилитров среды 7H9, содержащей 10% альбуминдекстрозы каталазы. Инокулируйте весь талый стебель глицерина в среду, чтобы оживить культуру, которая служит первичной культурой. Инкубируйте колбу с культурой при температуре 37 градусов Цельсия в вибростенде инкубатора со скоростью 100 оборотов в минуту в течение трех-четырех дней.
На пятый день измерьте поглощение на 600 нанометрах. Когда культура достигнет оптической плотности от 0,8 до одного, используйте ее для инокуляции вторичной культуры в 100 миллилитров среды 7H9, содержащей 10% ADC, в колбе объемом 500 миллилитров. Выращивайте вторичную культуру при температуре 37 градусов Цельсия в встряхивателе инкубатора со скоростью 100 оборотов в минуту в течение двух-трех дней.
Когда оптическая плотность на 600 нанометрах достигнет примерно 0,8, извлеките 10 микролитров культуры с помощью пипетки с фильтрующим наконечником и поместите ее на шнековую пластину LB без антибиотиков внутри бактериального колпака. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12–16 часов, чтобы проверить его на бактериальное загрязнение. Теперь инокулируйте бактерии из незагрязненной вторичной культуры в 100 миллилитров среды Саутона в колбе объемом 500 миллилитров.
Выращивайте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-четырех дней, пока оптическая плотность не достигнет примерно 0,8. Используйте культуру, выращенную до оптической плотности примерно 0,8 в среде Саутона, для инокуляции новых культур массой 300 миллилитров для приготовления фильтрата. Для начала приобретите 300 миллилитров логарифмической фазы культуры Mtb, выращенной в среде Sauton.
Скатите клетки в 50-миллилитровую пробирку при температуре 2,100 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. С помощью серологической пипетки объемом 25 миллилитров переложите 45 миллилитров надосадочной жидкости в новую пробирку, а нетронутую гранулу отложите для приготовления лизата цельных клеток. Повторите этап центрифугирования с надосадочной жидкостью при температуре 2, 100 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Переложите 40 миллилитров надосадочной жидкости в новую пробирку, оставив нетронутыми пять миллилитров. Теперь отфильтруйте надосадочную жидкость культуры с помощью шприцевого фильтра 0,2 микрона в новые пробирки. Инокулируйте один миллилитр фильтрата культуры на шнековую пластину и инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех недель, чтобы проверить его на загрязнение.
Ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре 1X PBS G, содержащем фенилметилсульфонилфторид, и 1X коктейле ингибиторов протеазы. Переложите лизат в двухмиллилитровую завинчивающуюся крышку В бусинную трубку, заполненную на одну треть шариками диоксида циркония 0,1 миллиметра. Выполните восемь циклов по одной минуте взбивания бусин, а затем две минуты инкубации на льду.
Центрифугируйте пробирку при 18 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, помещенную на лед. После повторения этапа центрифугирования отфильтровать надосадочную жидкость через шприцевой фильтр толщиной 0,2 микрометра для устранения патогенного бактериального загрязнения.
Храните лизаты при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для начала добавьте 15 миллилитров фильтрата культуры Mtb в фильтрующий блок centricon с температурой три килодальтона. Центрифугируйте пробирку при температуре 2, 100 G в течение одного часа при четырех градусах Цельсия.
Повторите этап центрифугирования от 15 до 16 раз, пока фильтрат культуры не уменьшится примерно до одного миллилитра. Аликвотировать 100 мкл концентрированной культуры фильтруют белки в 10 микроцентрифужных пробирок с низким содержанием белка. Оцените концентрацию белка с помощью набора для анализа белка бицинхониновой кислоты.
Добавьте 175 микролитров смешанного реагента в соответствии с инструкцией производителя. После смешивания образцов инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Измеряйте показания поглощения на 562 нанометрах с помощью считывателя ELISA.
