制备结 核分枝杆菌 培养滤液以了解结核病发病机制

Mtb 培养滤液的分泌物将深入了解病原体分泌的毒力因子或其他蛋白质，用于治疗干预。在这里，我们试图找出细菌分泌的蛋白质，这些蛋白质可以了解 Mtb 的分泌系统、其未知的毒力因子以及它们对宿主调节的影响，从而促进宿主内部病原体的生存。在 Mtb 研究领域，贝达喹啉、德拉马尼等药物可用于治疗 MDR 和外部应变。

关于开发 MDR 和 XDR 药物以及 Mtb 疫苗的研究仍在进行中。由于药物方案的不依从性，Mtb 的耐药性越来越多。治疗 MDR、XDR 菌株是 Mtb 研究领域最具挑战性的任务。

我们小组在该领域建立了多项重要发现。我们的实验室展示了 CFP-10 磷酸化对 Mtb 毒力的影响，并建立了 Mtb 的磷酸化蛋白质组、磷酸化分泌蛋白和分泌网络。此外，该实验室的一篇论文表明，SecA2 分泌蛋白介导宿主中的 DNA 损伤。

用培养过滤的蛋白质而不是细菌处理细胞会改变细胞因子水平和其他免疫调节因子。在分泌研究的帮助下，人们可以识别新的毒力因子及其在毒力中的作用。首先，从零下 80 摄氏度中取出四个独立的 Mtb 甘油茎，并在室温下解冻。

将 10 毫升含有 10% 白蛋白葡萄糖过氧化氢酶的 7H9 培养基倒入带螺帽的 100 毫升高压灭菌锥瓶中。将整个解冻的甘油茎接种到培养基中，以恢复作为原代培养物的培养物。将培养瓶在 37 摄氏度下在培养箱摇床中以每分钟 100 转的速度孵育 3 到 4 天。

第五天，测量 600 纳米处的吸光度。当培养物达到 0.8 比 1 之间的光密度时，用它在 500 毫升烧瓶中接种 100 毫升含有 10% ADC 的 7H9 培养基中的二次培养物。在 37 摄氏度的培养箱摇床中以每分钟 100 转的速度培养次生培养物，持续 2 到 3 天。

当 600 纳米的光密度达到约 0.8 时，使用带有过滤尖端的移液器取出 10 微升培养物，并将其点在 LB 螺旋板上，细菌罩内没有抗生素。将板在 37 摄氏度下孵育 12 至 16 小时，以检查是否有细菌污染。现在将来自无污染的二次培养物中的细菌接种到 500 毫升烧瓶中的 100 毫升 Sauton 培养基中。

在 37 摄氏度下培养培养物 3 到 4 天，直到光密度达到约 0.8。使用在 Sauton 培养基中生长至约 0.8 光密度的培养物接种新的 300 毫升培养物用于滤液制备。首先，获得在 Sauton 培养基中生长的 300 毫升对数期 Mtb 培养物。

在 50 mL 试管中以 2， 100 G 的浓度在 4 摄氏度下沉淀细胞 10 分钟。使用 25 mL 血清移液管，将 45 mL 上清液转移到新试管中，并将未接触的沉淀放在一边进行全细胞裂解物制备。用 2， 100 G 的上清液在 4 °C 下重复离心步骤 10 分钟。

将 40 mL 上清液转移到新试管中，保留 5 mL。现在使用 0.2 微米注射器过滤器将培养上清液过滤到新试管中。将 1 毫升等分试样的培养滤液接种到螺旋板上，并在 37 摄氏度下孵育 4 周以检查是否有污染。

将沉淀重悬于一毫升含有苯甲基磺酰氟的 1X PBS G 和 1X 蛋白酶抑制剂混合物中。将裂解物转移到 2 毫升螺旋盖 B 串珠管中，该管填充了 0.1 毫米氧化锆珠的三分之一。进行 8 个循环，每次 1 分钟的磁珠打浆，然后在冰上孵育 2 分钟。

将试管在 4 摄氏度下以 18， 000 G 离心 15 分钟。将上清液收集到置于冰上的新鲜 1.5 mL 微量离心管中。重复离心步骤后，通过 0.2 微米注射器过滤器过滤上清液，以消除病原菌污染。

将裂解物储存在零下 80 摄氏度。首先，将 15 毫升 Mtb 培养滤液添加到 3 千道尔顿中心的过滤装置中。将试管在 2， 100 G 下在 4 摄氏度下离心 1 小时。

重复离心步骤 15 至 16 次，直到培养滤液减少至约 1 毫升。将 100 μL 浓缩培养滤液蛋白质分装到 10 个低蛋白结合微量离心管中。使用二辛可宁酸蛋白测定试剂盒估计蛋白质浓度。

按照制造商的说明加入 175 微升混合试剂。混合样品后，在 37 摄氏度下孵育 1 小时。使用 ELISA 读数仪测量 562 纳米处的吸光度读数。