سيعطي إسرار مرشح ثقافة Mtb نظرة ثاقبة لعوامل الفوعة أو البروتينات الأخرى التي يفرزها العامل الممرض للتدخلات العلاجية. هنا ، نحاول معرفة البروتينات المفرزة بالبكتيريا التي من شأنها أن تعطي فكرة عن نظام إفراز Mtb ، وعوامل الفوعة غير المعروفة ، وتأثيرها على تعديل المضيف لبقاء العامل الممرض داخل المضيف. في مجال أبحاث Mtb ، يمكن استخدام أدوية مثل البيداكويلين والديلامانيد لعلاج الإخماد المتعدد الميكروبات والسلالات الخارجية.
لا تزال الأبحاث جارية حول تطوير الأدوية على MDR و XDR ، وكذلك لقاحات Mtb. يكتسب Mtb مقاومة أكثر فأكثر بسبب عدم الامتثال لأنظمة الأدوية. يعد علاج سلالات MDR و XDR المهمة الأكثر تحديا في مجال أبحاث Mtb.
وقد أنشأت مجموعتنا العديد من النتائج المهمة في هذا المجال. أظهر مختبرنا تأثير فسفرة CFP-10 في ضراوة Mtb ، وأنشأ شبكة phospho-proteome و phospho-secretum و secretum of Mtb. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت ورقة من المختبر أن إفراز SecA2 يتوسط تلف الحمض النووي في المضيف.
تؤدي معالجة الخلايا بالبروتينات المفلترة بالثقافة بدلا من البكتيريا إلى تغيير مستويات السيتوكين والعوامل المناعية الأخرى. بمساعدة دراسة الإسرار ، يمكن للمرء تحديد العوامل الخبيثة الجديدة ودورها في الفوعة. للبدء ، قم بإزالة أربعة سيقان جلسرين Mtb مستقلة من 80 درجة مئوية تحت الصفر وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة.
صب 10 مل من وسط 7H9 يحتوي على 10٪ ألبومين سكر العنب كاتالاز في قارورة مخروطية الأوتوكلاف سعة 100 مل بغطاء لولبي. قم بتلقيح ساق الجلسرين المذاب بالكامل في الوسائط لإحياء الثقافة التي تعمل كثقافة أساسية. احتضان قارورة الاستزراع عند 37 درجة مئوية في شاكر حاضنة بمعدل 100 دورة في الدقيقة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام.
في اليوم الخامس ، قم بقياس الامتصاص عند 600 نانومتر. عندما تصل المزرعة إلى كثافة بصرية بين 0.8 إلى واحد ، استخدمها لتلقيح الثقافة الثانوية في 100 مل من وسط 7H9 الذي يحتوي على 10٪ ADC في قارورة سعة 500 ملليلتر. قم بزراعة الثقافة الثانوية عند 37 درجة مئوية في شاكر حاضنة بمعدل 100 دورة في الدقيقة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.
عندما تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى حوالي 0.8 ، اسحب 10 ميكرولترات من المزرعة باستخدام ماصة بطرف مرشح ، وقم بوضعها على لوحة مثقاب LB بدون مضادات حيوية داخل غطاء البكتيريا. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة للتحقق من وجود تلوث بكتيري. الآن قم بتلقيح البكتيريا من الثقافة الثانوية الخالية من التلوث في 100 مل من وسط ساوتون في قارورة سعة 500 ملليلتر.
قم بزراعة المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام حتى تصل الكثافة البصرية إلى 0.8 تقريبا. استخدم المزرعة المزروعة إلى كثافة بصرية تبلغ حوالي 0.8 في وسط ساوتون لتلقيح مزارع جديدة سعة 300 ملليلتر لتحضير الترشيح. للبدء ، احصل على 300 مل من ثقافة Mtb في مرحلة السجل المزروعة في وسائط Sauton.
حبيبات الخلايا في أنبوب 50 ملليلتر عند 2 ، 100 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مليلتر ، انقل 45 مل من المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، واترك الحبيبات التي لم تمسها جانبا لتحضير محللات الخلية بالكامل. كرر خطوة الطرد المركزي باستخدام المادة الطافية عند 2 ، 100 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
انقل 40 مل من المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، مع ترك خمسة ملليلتر دون أن يمسها. الآن قم بتصفية المادة الطافية للثقافة باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرون في أنابيب جديدة. قم بتلقيح كميات ملليلتر واحد من ترشيح المزرعة على صفيحة المثقاب ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة أربعة أسابيع للتحقق من التلوث.
أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من 1X PBS G يحتوي على فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل ، وكوكتيل مثبط البروتياز 1X. انقل المحللة إلى أنبوب حرز بغطاء لولبي سعة ملليلتر ب مملوء بثلث حبات زركونيا 0.1 ملم. قم بإجراء ثماني دورات من دقيقة واحدة من ضرب الخرزة ، تليها دقيقتان من الحضانة على الجليد.
جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 18 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر يوضع على الجليد. بعد تكرار خطوة الطرد المركزي ، قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر للقضاء على التلوث البكتيري المسببة للأمراض.
قم بتخزين المحللات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. للبدء ، أضف 15 مل من ترشيح ثقافة Mtb إلى وحدة مرشح مركزية بسعة ثلاثة كيلودالتون. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 2 ، 100 جم لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.
كرر خطوة الطرد المركزي من 15 إلى 16 مرة حتى ينخفض ترشيح المزرعة إلى مليلتر واحد تقريبا. Aliquot 100 ميكرولتر من بروتينات المزرعة المركزة في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة ملزمة منخفضة البروتين. تقدير تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص بروتين حمض البيسينشونيك.
أضف 175 ميكرولترا من الكاشف المختلط حسب تعليمات الشركة المصنعة. بعد خلط العينات ، احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بقياس قراءات الامتصاص عند 562 نانومتر باستخدام قارئ ELISA.
