Что касается всех пациентов с микоплазмой, их диагноз Mycoplasm pneumoniae является сложным из-за перекрестных реакций. Предлагаемый нами ИФА основан на селективном истощении неспецифических антигенов Mycoplasm pneumoniae с использованием метода адсорбции. Собственный ИФА захвата антигена, описанный в этом видео, гарантирует высокую специфичность пространства.
И на самом деле, он зарекомендовал себя как надежный скрининговый тест для точной диагностики инфекции Mycoplasm pneumoniae. Демонстрировать шаги перед ИФА будет Имен Чниба, аспирант. А на ступенях ИФА будет Надин Хадрауи, техник из нашей лаборатории.
Чтобы начать процедуру адсорбции антигенов, вытащите 12 гетерологичных бактериальных антигенов в микроцентрифужную трубку и отрегулируйте концентрацию белка, соответствующую половине антисыворотки, подлежащей адсорбированию. Затем центрифугируйте смесь антигенов при 14 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы собрать гранулу. Затем повторно суспендировать гранулу с очищенным поликлональным антимикоплазмой пневмонией IgG и инкубировать в течение двух часов при 37 градусах Цельсия с медленным перемешиванием.
В конце инкубации центрифугируют суспензию снова при 14 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и восстанавливают супернатант, соответствующий специфическому поликлональному антисывороту Mycoplasma pneumoniae. Чтобы покрыть 96-луночную ИФА-пластину захватным антителом, разводят антитело до 10 мкг на миллилитр и 0,1 молярного карбонатного бикарбонатного буфера при рН 9,6. Затем добавляют 100 микролитров разбавленного антитела к каждой лунке микропластины и инкубируют в течение ночи при четырех градусах Цельсия.
На следующий день снимите раствор покрытия и вымойте пластину пять раз моющим буфером. Далее блокируют несвязанные поверхности покрытых скважин, добавляя в каждую скважину по 100 микролитров блокирующего раствора. После инкубации пластины от одного часа при комнатной температуре удалите блокирующий раствор пипеткой и промойте пластину, как было показано ранее.
Добавьте равное количество цельных белков Mycoplasma pneumoniae в концентрации 10 нанограмм на лунку и дайте реакции антиген-антитело протекать в течение двух часов при комнатной температуре. После инкубации удалите избыток антигена и вымойте пластину, как показано. Затем разбавьте образцы сыворотки крови человека и ссылайтесь на положительный и отрицательный контроль сыворотки.
Затем добавьте 100 микролитров разбавленных проб и контрольных образцов в соответствующие скважины и дубликаты. Пометьте лунки, не содержащие ни антигена, ни сыворотки, как пустые. После инкубации тарелки в течение 90 минут при комнатной температуре удалите раствор сыворотки и промойте пластину пять раз с помощью промывочного буфера.
Пипетка 100 микролитров соответствующего разбавленного фермента конъюгированных детектирующих антител к каждой лунке и инкубируют в течение одного часа при 37 градусах Цельсия в темноте. После удаления несвязанных органов обнаружения и промывки пластины добавляют 100 микролитров раствора хромогена TMB для визуализации связывания антигена с антителом. Дайте пластине развиться в течение 30 минут при комнатной температуре.
Затем остановите реакцию, добавив 100 микролитров 7,5% серной кислоты. Наконец, считайте поглощение на 450 нанометров с помощью микропластичного считывателя и отсортируйте результаты на основе расчета индекса позитивности. Иммуноблотический анализ между Mycoplasma pneumoniae неассорбированной поликлональной антисывороткой и гетерологичными бактериальными антигенами выявил перекрестную реактивность, но с различной интенсивностью.
Например, антигены Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma imitans показали самую сильную реактивность, несмотря на то, что они были птичьими микоплазмами. Напротив, ни один из двух человеческих клинических изолятов Ureaplasma urealyticum не показал никакой реакции. Однако антигены остальных видов генитальных микоплазм человека и другие бактериальные антигены давали значительные перекрестные реакции с антисывороткой.
Иммуноблотический анализ подтвердил эффективность поликлональной антисыворотной адсорбции Mycoplasma pneumoniae против гетерологичных бактериальных антигенов. Процедура адсорбции устранила все перекрестные реакции, тем самым сделав Mycoplasma pneumoniae antiserum специфичным для всех последующих серологических и иммуноблоттинговых тестов. Кроме того, набор человеческих сывороток, протестированных с использованием ИФА захвата антигена, разработанный в этом исследовании, оказался положительным для Mycoplasma pneumoniae IgG с хорошей специфичностью.
Специфика этого ИФА в основном страхуется методом адсорбции, так как изначально необходимо тщательно выполнять этот критический шаг и повторять его не менее двух или трех раз. Принцип этой методики может быть применен для диагностики других видов микоплазм или других бактерий в целом. Однако отбор бактериальных антигенов для адсорбции должен быть неактуальным и адекватным.
