أما بالنسبة لجميع مرضى الميكوبلازم ، فإن تشخيصهم بالميكوبلازم الرئوي يمثل تحديا بسبب ردود الفعل المتقاطعة. يعتمد ELISA المقترح لدينا على الاستنفاد الانتقائي لمستضدات الميكوبلازم الرئوية غير المحددة باستخدام تقنية الامتزاز. يضمن التقاط المستضد الداخلي ELISA الموصوف في هذا الفيديو خصوصية واسعة عالية.
وفي الواقع ، لقد ثبت أنه اختبار فحص موثوق به لتشخيص دقيق لعدوى الميكوبلازم الرئوية. ستوضح خطوات ما قبل ELISA إيمان شنيبا ، طالبة دكتوراه. وستكون خطوات ELISA نادين خضراوي ، وهي فنية من مختبرنا.
لبدء إجراء امتزاز المستضد ، اسحب 12 مستضدا بكتيريا غير متجانس إلى أنبوب طرد مركزي دقيق واضبط تركيز البروتين المقابل لنصف المصل المضاد المراد امتصاصه. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لخليط المستضد عند 14،000 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لجمع الحبيبات. ثم, إعادة تعليق بيليه مع تنقية متعددة النسيلة المضادة للميكوبلازما الرئوية IgG واحتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع التحريض البطيء.
في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للتعليق مرة أخرى عند 14،000 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية واستعادة المادة الطافية المقابلة لمصل الميكوبلازما الرئوية متعدد النسيلة. لطلاء صفيحة ELISA ذات 96 بئرا بجسم مضاد للالتقاط ، قم بتخفيف الجسم المضاد إلى 10 ميكروغرام لكل ملليلتر و 0.1 محلول بيكربونات كربونات المولي عند درجة الحموضة 9.6. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الطلاء وغسل اللوحة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل. بعد ذلك ، قم بسد الأسطح غير المنضمة للآبار المطلية بإضافة 100 ميكرولتر من محلول الحجب إلى كل بئر. بعد احتضان اللوحة من ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة محلول الحجب باستخدام ماصة واغسل اللوحة كما هو موضح سابقا.
أضف كمية متساوية من البروتينات الكاملة الميكوبلازما الرئوية بتركيز 10 نانوجرام لكل بئر واترك تفاعل مولد الضد والجسم المضاد يحدث لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة المستضد الزائد وغسل اللوحة كما هو موضح. بعد ذلك ، قم بتخفيف عينات اختبار المصل البشري والإشارة إلى ضوابط المصل الإيجابية والسلبية.
بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من عينات الاختبار المخففة والضوابط في الآبار والتكرارات المناسبة. ضع علامة على الآبار التي لا تحتوي على مستضد أو أمصال فارغة. بعد احتضان اللوحة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة محلول المصل وغسل اللوحة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل.
ماصة 100 ميكرولتر من الإنزيم المخفف المناسب المترافق الكشف عن الأجسام المضادة لكل بئر واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في الظلام. بعد إزالة أجسام الكشف غير المنضمة وغسل اللوحة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول TMB Chromogen لتصور ارتباط الجسم المضاد بالمستضد. دع اللوحة تتطور لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ثم أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من حمض الكبريتيك بنسبة 7.5٪. أخيرا ، اقرأ الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة وقم بفرز النتائج بناء على حساب مؤشر الإيجابية. كشف تحليل اللطخة المناعية بين الميكوبلازما الرئوية غير الممتصة متعددة النسيلة والمستضدات البكتيرية غير المتجانسة عن تفاعل متقاطع ولكن بكثافة متفاوتة.
على سبيل المثال ، أظهر مستضدات الميكوبلازما غاليسبتيكوم ومستضدات الميكوبلازما إيميتان أقوى تفاعل على الرغم من كونها ميكوبلازما الطيور. في المقابل ، لم تظهر أي من العزلتين السريريتين البشريتين ل Ureaplasma urealyticum أي تفاعل. ومع ذلك ، أسفرت مستضدات أنواع الميكوبلازما التناسلية البشرية المتبقية والمستضدات البكتيرية الأخرى عن تفاعلات متقاطعة كبيرة مع المصل المضاد.
أكد تحليل اللطخة المناعية كفاءة امتزاز المصل متعدد النسيلة الميكوبلازما الرئوية ضد المستضدات البكتيرية غير المتجانسة. ألغى إجراء الامتزاز جميع التفاعلات المتقاطعة ، مما جعل المصل المضاد للميكوبلازما الرئوية محددا لجميع الاختبارات المصلية والمناعية اللاحقة. علاوة على ذلك ، أثبتت مجموعة الأمصال البشرية التي تم اختبارها باستخدام التقاط المستضد ELISA التي تم تطويرها في هذه الدراسة أنها إيجابية للميكوبلازما الرئوية IgG مع خصوصية جيدة.
يتم تأمين خصوصية ELISA بشكل أساسي من خلال تقنية الامتزاز ، حيث أنه من الأساسي إجراء هذه الخطوة الحاسمة بعناية وتكرارها مرتين أو ثلاث مرات على الأقل. يمكن تطبيق مبدأ هذه التقنية لتشخيص أنواع الميكوبلازما الأخرى أو البكتيريا الأخرى بشكل عام. ومع ذلك ، يجب أن يكون اختيار المستضدات البكتيرية للامتزاز غير ذي صلة وكاف.
