Como para todos los pacientes con micoplasma, su diagnóstico de Mycoplasm pneumoniae es difícil debido a las reacciones cruzadas. Nuestro ELISA propuesto se basa en la depleción selectiva de antígenos inespecíficos de Mycoplasm pneumoniae utilizando una técnica de adsorción. El ELISA de captura de antígenos interno descrito en este video garantiza una alta especificidad de espacios.
Y en realidad, ha demostrado ser una prueba de detección confiable para un diagnóstico preciso de la infección por Mycoplasma pneumoniae. Demostrando los pasos previos a ELISA estará Imen Chniba, un estudiante de doctorado. Y los pasos de ELISA serán Nadine Khadraoui, una técnica de nuestro laboratorio.
Para comenzar el procedimiento de adsorción de antígenos, tire de los 12 antígenos bacterianos heterólogos en un tubo de microcentrífuga y ajuste la concentración de proteína correspondiente a la mitad del antisuero a adsorber. A continuación, centrifugar la mezcla de antígenos a 14, 000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para recoger el pellet. Luego, vuelva a suspender el pellet con el policlonal purificado anti-Mycoplasma pneumoniae IgG e incube durante dos horas a 37 grados centígrados con agitación lenta.
Al final de la incubación, centrifugar la suspensión nuevamente a 14, 000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y recuperar el sobrenadante correspondiente al antisuero policlonal específico Mycoplasma pneumoniae. Para recubrir una placa ELISA de 96 pocillos con un anticuerpo de captura, diluya el anticuerpo a 10 microgramos por mililitro y tampón de bicarbonato de carbonato molar de 0.1 a pH 9.6. Luego, agregue 100 microlitros del anticuerpo diluido a cada pocillo de la microplaca e incube durante la noche a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, retire la solución de recubrimiento y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado. A continuación, bloquee las superficies no unidas de los pozos recubiertos agregando 100 microlitros de la solución de bloqueo a cada pozo. Después de incubar la placa desde una hora a temperatura ambiente, retire la solución de bloqueo con una pipeta y lave la placa como se demostró anteriormente.
Añadir una cantidad igual de proteínas enteras de Mycoplasma pneumoniae a una concentración de 10 nanogramos por pocillo y permitir que la reacción antígeno-anticuerpo tenga lugar durante dos horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el exceso de antígeno y lave la placa como se demuestra. A continuación, diluya las muestras de prueba de suero humano y haga referencia a los controles de suero positivos y negativos.
Luego, agregue 100 microlitros de las muestras de prueba diluidas y los controles en los pocillos y duplicados apropiados. Marque los pocillos que no contienen antígeno ni sueros como en blanco. Después de incubar la placa durante 90 minutos a temperatura ambiente, retire la solución de suero y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado.
Pipetear 100 microlitros de la enzima diluida adecuada conjugada anticuerpos de detección a cada pocillo e incubar durante una hora a 37 grados centígrados en la oscuridad. Después de retirar los cuerpos de detección no unidos y lavar la placa, agregue 100 microlitros de solución TMB Chromogen para visualizar la unión antígeno-anticuerpo. Deje que la placa se desarrolle durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Luego, detenga la reacción agregando 100 microlitros de ácido sulfúrico al 7.5%. Finalmente, lea la absorbancia a 450 nanómetros utilizando un lector de microplacas y ordene los resultados en función del cálculo del índice de positividad. El análisis de inmunoblot entre el antisuero policlonal no adsorbido Mycoplasma pneumoniae y los antígenos bacterianos heterólogos reveló reactividad cruzada pero con intensidad variable.
Por ejemplo, los antígenos Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma imitans mostraron la mayor reactividad a pesar de ser micoplasmas aviares. Por el contrario, ninguno de los dos aislados clínicos humanos de Ureaplasma urealyticum mostró ninguna reacción. Sin embargo, los antígenos de las especies restantes de micoplasma genital humano y otros antígenos bacterianos produjeron reacciones cruzadas considerables con el antisuero.
El análisis de inmunoblot confirmó la eficacia de la adsorción policlonal antisuero Mycoplasma pneumoniae contra los antígenos bacterianos heterólogos. El procedimiento de adsorción eliminó todas las reacciones cruzadas, lo que hizo que el antisuero Mycoplasma pneumoniae fuera específico para todas las pruebas serológicas e inmunotransferencia posteriores. Además, el conjunto de sueros humanos probados utilizando el ELISA de captura de antígeno desarrollado en este estudio resultó positivo para Mycoplasma pneumoniae IgG con buena especificidad.
La especificidad de este ELISA está asegurada principalmente por la técnica de adsorción, ya que es primordial realizar este paso crítico con cuidado y repetirlo al menos dos o tres veces. El principio de esta técnica se puede aplicar para diagnosticar otras especies de micoplasma u otras bacterias en general. Sin embargo, la selección de antígenos bacterianos para la adsorción debe ser irrelevante y adecuada.
