Говоря о значимости, генерация NK-клеток из расширяемого источника имеет решающее значение для таких применений, как иммунотерапия рака. Преимущество этой технологии заключается в том, что вместо обычных IP-клеток могут использоваться расширенные потенциальные стволовые клетки, обладающие более широкой дифференцировочностью. Для предварительной дифференцации hEPSC удалите среду hEPSC, в которой поддерживались клетки, и добавьте один миллилитр среды DFK.
Инкубировать в течение двух-трех дней при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Чтобы проверить образование эмбриоидных тел, после удаления отработанной среды DFK промыть клетки один раз одним миллилитром PBS. Добавьте 500 микролитров 0,05% трипсина и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех-семи минут, исходя из морфологии.
После этого трипсин удаляется, и два миллилитра ДФК из среды собирают клетки. Раскрутите ячейки при 300 г в течение трех минут при комнатной температуре. После удаления супернатанта добавьте один миллилитр среды DFK и один микролитр Y-27632 и повторно суспендируйте клетки путем щелчка.
Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и разбавьте клеточную суспензию средой DFK и Y-27632 для получения 4000 клеток на 25 микролитров среды. Поместите от 30 до 40 капель клеточной суспензии на крышку 10-сантиметровой чашки Петри и налейте немного PBS в нижнюю чашку, чтобы предотвратить испарение капель. Аккуратно переверните крышку, чтобы покрыть блюдо и высиживать при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех дней.
Для сбора эмбриоидных тел из капли, используя одномилитровую пипетку, содержащую PBS, накачайте немного PBS в каплю и аспирируйте среду, включая эмбриоидные тела. Затем перенесите эти эмбриоидные тела в 15-миллилитровую трубку и раскрутите их вниз при 100 г в течение одной минуты при комнатной температуре. После удаления супернатанта добавляют один миллилитр среды А. Перенесите собранные эмбриоидные тела на неприлипшую 24-луночную пластину и считайте ее нулевым днем.
Чтобы выполнить мезодермный рисунок эмбриоидных тел, инкубируйте пластину в течение трех дней при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом. На второй день замените 500 микролитров отработанной среды А свежей средой А того же объема. Для выполнения гематоэндотелиальной спецификации эмбриоидного тела удаляют из лунки 700 микролитров среды А и добавляют такой же объем среды В.Культуры в течение семи дней, меняя полусреду каждые два дня.
Чтобы перенести узорчатые эмбриоидные тела на границу раздела воздух-жидкость, слегка наклоните пластину, чтобы эмбриоидные тела объединились внизу, и, используя пипетку в один миллилитр, удалите как можно больше среды B. Теперь подберите тела эмбриона пипеткой путем аспирации оставшейся среды и перенесите их в транс-лунку в 24-луночной пластине, Чтобы выполнить расширение лимфоидного предшественника, добавьте 500 микролитров среды NK-1 в нижний отсек транс-лунки, культивируйте в течение 14 дней и выполняйте изменение среды через день. Чтобы покрыть пластину, разбавьте материал покрытия в PBS, добавьте один миллилитр разбавленного раствора покрытия в каждую лунку 12-луночной пластины и накройте отверстие пластины обмоточной пленкой.
Инкубируйте пластину при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Добавьте 200 микролитров PBS в транс-лунку и медленно пипеткой вверх и вниз примерно пять-шесть раз, чтобы собрать клетки, высвобождаемые из органоидов. Переложите собранную клеточную суспензию в двухмиллилитровую трубку и раскрутите клетки при 500 Г в течение пяти минут при комнатной температуре.
После удаления супернатанта повторно суспендируют клетки в одном миллилитре среды NK-1. Удалите весь раствор покрытия из скважины и дважды промойте каждую лунку 12-луночной пластины одним миллилитром PBS. Затем разделите собранные клетки в соотношении 1:2 и перенесите клеточную суспензию на покрытую 12-луночную пластину.
Добавьте один миллилитр среды NK-1, чтобы каждая скважина имела 1,5 миллилитра среды. Для изменения среды дайте клеткам опуститься на дно на одну-две минуты. Затем тщательно аспирируйте 750 микролитров среды и раскрутите ее вниз, как было продемонстрировано ранее.
После выброса супернатанта повторно суспендируют полученную гранулу в 750 микролитрах среды НК-1 путем пипетки пять-шесть раз и перекладывают ее в исходную скважину. В настоящем исследовании были проанализированы продукты, полученные из hEPSC в конечной точке. Приблизительно 15% клеток, диссоциированных от системы 3D-культур из двух партий, индуцированных в разные моменты времени, были CD3-отрицательными, CD56-положительными, а 16% клеток были CD45-положительными, CD-56-положительными, что соответствует проценту CD3-отрицательных, CD56-положительных клеток, наблюдаемых в более ранних испытаниях.
Процентное содержание CD3-отрицательных, CD56-положительных клеток в клетках, собранных из системы 2D-культур, варьировалось от 30 до 6% Продукты, полученные из hEPSC, в течение 18-го дня культуры из 2D-системы показали экспрессию как эктопического CD56, так и CD107a в 12% клеток после двух часов стимуляции антител, и примерно 28% собранных клеток были CD94-положительными, CD159a-положительный. Продукты дифференцировки in vitro были протестированы на цитотоксичность в отношении клеток эритролейкемии человека K562. При совместном культивировании с опухолевыми мишенями в течение трех часов дифференцированные продукты демонстрируют умеренную цитотоксичность по сравнению с интерлейкиновыми 2-независимыми постоянными клетками NK92mi.
Следуя этому методу, могут быть получены такие клетки, как Т-клетки, В-клетки и эритроциты.
