Мы представляем метод для генерации человека индуцированной плюрипотентных стволовых клеток, полученных опухолевых антиген-специфических CD8 альфа-бета однопогодных Т-клеток с помощью OP9-Delta-1 совместной культуры системы. Этот метод является мощным инструментом для выработки Т-клеток in vitro и будет способствовать развитию Т-клеток, полученных в пробирке, для использования в регенеративной медицине и клеточной терапии. Он также может быть адаптирован для генерации других лимфоцитов, таких как НК-клетки.
При выполнении этого метода, важно предварительно оценить много FBS и прохождения OP9-Delta-1 клетки последовательно, когда от клетки к клетке цитоплазмический контакт начинают предотвращать дифференциацию клеток и сенесценции. Демонстрацией процедуры будет доктор Меган Гуд, хирургическая онкология из моей команды. Начните с проверки человеческих колоний iPSC в стерео-микроскопе, и удалите любые области дифференциации от культуры с пластиковым краем 200-микролитрового наконечника пипетки.
Когда диаметр колоний достигает от 0,8 до 1,2 миллиметра, проходят человеческие iPSCs. Аспирировать оттраченные средства массовой информации, и добавить 10 миллилитров человека iPSC средств массовой информации дополняется 10-микромолярный ингибитор ROCK. Roll одноразовые ячейки проходной инструмент по всей блюдо в одном направлении, убедившись, что для поддержания равномерного давления и что весь ролик лезвие касается культуры блюдо.
Поверните культуру блюдо 90 градусов, и повторить прокатки. Визуально подтвердить правильную резку колоний с помощью микроскопа. Они должны казаться клетчатыми.
Затем отсоедините разрезанные колонии нежным механическим промывкой 200-микролитровой пипеткой. Визуально оцените количество колоний комков и перенесите от 350 до 600 комков в новое 10-сантиметровое блюдо эмбриональных фибробластов мыши с 10 миллилитров свежих человеческих iPSC-средств, дополненных ингибитором ROCK. Инкубировать блюдо на ночь при 37 градусах по Цельсию.
На следующий день, аспирировать провел средств массовой информации, и добавить 10 миллилитров свежих человеческих средств массовой информации iPSC. Изменение мультимедиа каждые один или два дня, в зависимости от скорости роста ячейки. Культура OP9-Delta-1 клетки в OP9 СРЕДСТВ массовой информации при 37 градусов по Цельсию.
Когда они достигают слияния, аспирировать средства массовой информации, и мыть клетки один раз с пятью миллилитров 1x магния, кальция и фенола красный свободный PBS. Аспирировать PBS, добавить два миллилитров 05%трипсина-ЭДТА, и инкубировать клетки в течение пяти минут при 37 градусов по Цельсию. Затем добавьте четыре миллилитров средств OP9 и механически отмежевать клеточный слой от труб.
Перенесите подвеску клетки в 50-миллилитровую коническую трубку через 100-микрометровый клеточный ситечко и центрифугу при 300 градусах при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно помыть клетки в 12 миллилитров СРЕДСТВ OP9. Добавьте восемь миллилитров средств массовой информации OP9 к каждому из шести новых блюд клеточной культуры, и пластины два миллилитров OP9-дельта-1 клеточной подвески на каждом блюде.
Рок блюдо из стороны в сторону и спереди назад, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию, и повторить проход, когда клетки достигают слияния. Приготовьте желатинированные блюда OP9-Delta-1 за неделю до совместной культуры с человеческими iPSCs.
Добавьте четыре миллилитров 0,1%желатина к трем новым блюдам клеточной культуры и инкубировать их в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию. После инкубации, аспирировать желатин, и добавить восемь миллилитров OP9 средств массовой информации для каждого блюда. Прохождение одного стеченного блюда op9-Delta-1 клеток до трех желатин покрытием блюд.
Через четыре дня, добавить 10 миллилитров OP9 средств массовой информации для каждого блюда клеток, в общей сложности 20 миллилитров средств массовой информации на блюдо. Начните совместное культуру человека iPSC на OP9-Delta-1 стеченных блюд семь-восемь дней после прохода клеток. Оспирировать средства массовой информации из стечения блюдо человека iPSCs, и добавить 10 миллилитров OP9 средств массовой информации.
Отрежьте и отсоедините колонии клеток с помощью одноразового инструмента пропуска клеток и перенесите от 350 до 600 скоплений разрезанных колоний на предварительно желатинизированное блюдо OP9-Delta-1 с 10 миллилитров свежих средств массовой информации OP9. Рок культуры блюдо из стороны в сторону и спереди назад, чтобы обеспечить равномерное распределение колоний. На следующий день, аспирировать провел средств массовой информации, и заменить его на 20 миллилитров свежих средств массовой информации OP9.
Человеческие скопления iPSC, со-культурные на OP9-Delta-1 в течение одного дня, должны выглядеть как маленькие, круглые, однослойные колонии. На пятый день, аспирировать 10 миллилитров оттраченных средств массовой информации, и добавить 10 миллилитров свежих средств массовой информации OP9. Колонии начнут дифференцироваться в примитивный мезодерм, который характеризуется многослойным темным центром.
Повторите этот процесс на девятый день, после чего многослойные центральные конструкции будут эволюционировать в куполообразные формы. Урожай гематопоэтических клеток-предшественников на 13-й день, после чего структуры состоят из темного центрального органоида, окруженного сетью куполоподобных областей. Аспирировать средства массовой информации, и мыть клетки один раз с пятью миллилитров 1x фенол красно-бесплатный раствор соли Hanks'balanced с кальцием и магнием, или HBSS.
После мытья добавьте 250 микролитров коллагеназы 5 000 единиц на миллилитр IV до 10 миллилитров HBSS. Добавить смесь в клетки, и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 45 минут. Аспирировать смесь HBSS-коллагеназы, и мыть клетки один раз с пятью миллилитров PBS.
После мытья с PBS, добавить пять миллилитров 0,25%трипсина-ЭДТА, и инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Затем добавьте четыре миллилитров мультимедиа OP9 и отмежеваться от клеточного слоя путем трубопроводов, чтобы сделать одноклеточную подвеску. Перенесите подвеску клетки в 50-миллилитровую коническую трубку через 100-микрометровый ситечко и центрифугировать трубку при 300 г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.
Аспирировать супернатант, и повторного перерасхода клеток в 10 миллилитров OP9 средств массовой информации. Плита клеточной суспензии на новый желатиновый 10-сантиметровый элемент культуры блюдо, и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 45 минут. Затем соберите любые неприемные клетки, нежно трубя.
Перенесите подвеску клетки в 50-миллилитровую коническую трубку через ситечко и центрифугу, как описано ранее. Затем, аспирировать супернатант, и повторного перерасхода клеток в 10 миллилитров дифференциации средств массовой информации. Плита клеточной подвески на новое op9-Delta-1 слияние блюдо.
Проходят клетки на 16-й день в соответствии с рукописными указаниями и продолжают проходить через неприемные клетки каждые пять-семь дней после этого. После 35 дней дифференциации обогатить CD4-положительной популяции клеток CD4 магнитной изоляции шарика в соответствии с протоколом производителя. Затем, повторное приостановление клеток в OP9 средств массовой информации, и пластины один миллилитр клеточной подвески в каждом колодец ткани культуры, плоский дно, 24-хорошо пластины стечения OP9-Delta-1.
Стимулируя клетки, добавляя 100 международных единиц человеческого IL-2, пять нанограммов человеческого IL-7, 500 нанограммов анти-человеческого антитела CD3, и два микрограмма анти-человеческого антитела CD28 к каждой хорошо. Через четыре-семь дней клетки могут быть собраны для дальнейшего анализа. После культуры на не желатинизированных OP9-Дельта-1 в присутствии человеческого фактора стволовых клеток, человека FLT3-лиганд, и человека интерлеукин-7, гематопоэтические прародители дифференцированы в CD3, CD7, CD4, и CD8 двойной положительной Т-линии клеток, большинство из которых выразили Т-клеточных рецепторов, характерных для ЭПИтопа MART1.
Когда CD4, CD8 двойной положительный Т-клеток были стимулированы анти-человеческих CD3 и CD28 антител в присутствии человека интерлейкин-7 и 2, число CD3-положительных CD8 альфа-бета-однопозитимных клеток увеличилось и остается специфическим для эпитопа MART1, подтверждающие сохранение их унаследованной специфичности антигена. Анализ ELISpot показал, что, когда культурный в присутствии пептида MART1, человека iPSC-производных CD8 альфа-бета-однополучевых Т-клеток выделяют большее количество интерферона гамма по сравнению с объемными и CD8 альфа альфа-альфа-однополучевых Т-клеток. Не было обнаружено никакой гамма-экспрессии интерферона только для Т-клеток и антиген-представляя клеток, демонстрируя, что Т-клетки, полученные человеком T-iPSC, являются специфическими и функциональными.
Важным шагом в этом методе является CD4 магнитного обогащения бисера для устранения CD4-отрицательных, CD8-отрицательных двойных отрицательных клеток, которые могут вызвать прямое убийство двойных положительных клеток при стимуляции. Этот метод применим для использования с несколькими источниками человеческих клеток, включая гематопоэтические стволовые клетки и эмбриональные стволовые клетки. iPSC полученных незрелых Т-клеток, порожденных этим методом может быть дополнительно улучшена для генерации зрелых опухолевых антигенов человека конкретных наивных Т-клеток для будущего терапевтического использования.
После просмотра этого видео, зритель должен понять, как генерировать человека iPSC полученных CD8 альфа-бета-одно-положительных Т-клеток с помощью OP9-Delta-1 совместной культуры системы.
