Область наших исследований в основном сосредоточена на разработке человеческих iPSC car NK-клеток с улучшенной противоопухолевой активностью и стойкостью in vivo для лучшего лечения различных злокачественных опухолей. С помощью этого нового протокола генерации CAR iPSC NK мы стремимся ответить на вопрос, как эти клетки могут преодолеть устойчивость опухоли к микроокружающей среде, повысить эффективность и обеспечить безопасное и масштабируемое производство. Основными экспериментальными задачами при создании CAR-NK-клеток, полученных из iPSC, являются достижение последовательной и эффективной дифференцировки iPSC в функциональные в случаях, обеспечивающих стабильную экспрессию CAR без каких-либо побочных эффектов, и улучшение персистенции in vivo.
Кроме того, исследователи сталкиваются с проблемами масштабируемости, иммунного отторжения и регуляторных держателей для клинического применения. Мы значительно продвинулись вперед в исследованиях CAR NK-клеток, полученных из iPSC, обеспечив эффективную интеграцию генов CAR без вирусов с использованием модификаций генов на основе транспозонов. Кроме того, мы оптимизировали CRISPR-Cas9 на уровне iPSC для удаления иммунных контрольных точек, факторы TMA для улучшения и эффективности клеток и опухолей, а также персистенцию in-vivo в моделях солидных опухолей.
С помощью нашего протокола с использованием невирусной экспрессии гена CAR, опосредованной комбинированным вектором, мы стремимся устранить пробел в разработке безопасной, эффективной и масштабируемой модификации генов для iPSC CAR NK-клеток, этот метод снижает риск инсерционного мутагенеза, повышает воспроизводимость и экономическую эффективность создания CAR-NK-клеток для иммунотерапии рака. В будущем наша лаборатория сосредоточится на разработке новых NK-клеток, полученных из iPSC, нацеленных на иммунные контрольные точки. Мы также будем исследовать воздействие на различные опухолевые микрофакторы окружающей среды с использованием биспецифических или триспецифических антител для повышения специфичности, персистенции in vivo и противоопухолевой активности.
Чтобы начать спиновое тело эмбриона или процесс формирования БЭ, примерно 200 000 сконструированных CAR iPSC на лунку в предварительно закодированной пластине с шестилуночной базальной мембраной, содержащей избыток MT, инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом, через два дня удалить питательную среду и отделить клетки путем инкубации с одним миллилитром предварительно подогретого TrypLE Select при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем тщательно диссоциируйте клеточные агрегаты в одноклеточную суспензию и перенесите суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Добавьте три миллилитра PBS, чтобы остановить реакцию диссоциации.
Затем повторно суспендируйте элементы в среде MK SR-plus и отфильтруйте их через сетчатый фильтр 70 микрометров для удаления агрегатов. Центрифугируйте клетки. Промойте гранулы пятью миллилитрами PBS, а затем повторно суспендируйте их в одном миллилитре среды для образования EB.
После подсчета разбавляют клетки до соответствующей плотности с помощью среды для образования EB, содержащей цитокины и 10 микромолярный ингибитор ROCK. С помощью многоканальной пипетки затравку затравливают от 3000 до 10 000 клеток на лунку в 100 микролитров среды EB в 96-луночный планшет. Центрифугируйте клетки при 300 G в течение пяти минут и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение шести дней.
Чтобы проверить качество тела эмбриона, сначала приготовьте четыре миллилитра предварительно подогретого 0,25% трипсина с 0,4% куриной сывороткой для диссоциации БЭ. через шесть дней переложите от 10 до 30 БЭ в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Добавьте к БЭ раствор куриной сыворотки трипсина и выдержите их на водяной бане.
Вихревание БЭ во время диссоциации каждые три-пять минут в течение 10 минут. Пипеткой трипсинизированные БЭ перемешивайте вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить полную диссоциацию. Затем добавьте пять миллилитров PBS, чтобы остановить процесс трипсинизации.
Отфильтруйте раствор ячейки через сетчатый фильтр 70 микрометров в новую коническую трубку. Затем центрифугируйте ячейки при 300 G в течение пяти минут и повторно суспендируйте гранулу в трех-пяти миллилитрах свежей среды EB. После подсчета окрашивайте клетки типичными маркерами БЭ.
Добавьте рекомендуемый объем антител в каждую пробирку, содержащую диссоциированные одиночные клетки БЭ в 100 микролитрах проточного буфера, и инкубируйте на льду в течение 30 минут. После инкубации дважды промойте клетки проточным буфером. Добавьте SYTOX синий окрашиватель для живых мертвецов и проанализируйте с помощью анализа проточной цитометрии.
Начните с кодирования каждой лунки шестилуночного планшета пятью-10 микролитрами 2%-ного стерилизованного раствора желатина. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-четырех часов. После инкубации аспирируйте оставшийся раствор желатина и добавьте три миллилитра естественного киллера или среды для дифференцировки NK, содержащей цитокины, в каждую лунку шестилуночного планшета, покрытого желатином.
Затем с помощью пипетки объемом в один миллилитр осторожно перенесите спиновые EB, полученные из сконструированных CAR iPSC, на 10-сантиметровую чашку. Добавьте три миллилитра среды для дифференцировки NK, содержащей цитокины, в каждую лунку шестилуночного планшета. Использование микропипетки объемом в один миллилитр распределяет от 16 до 20 EB в каждую лунку из шести лунок планшета и инкубирует при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа в течение трех-четырех недель.
После инкубации оценивают экспрессию маркеров NK-клеток CD45-положительных и CD56-положительных методом проточной цитометрии на суспензионных клетках. Когда более 80% суспензионных клеток экспрессируют CD45-положительный и CD56-положительный. Соберите клетки, пропустив их через фильтр 70 микрометров, чтобы удалить комки.
Перед совместным культивированием искусственных антигенпрезентирующих клеток или искусственных АПК в NK-клетках облучают искусственные АПК 100 серым цветом и сохраняют их в виде замороженных стеблей. После заготовки NK-клеток культивируют их в плотности пять умно-10 в степени пяти клеток на миллилитр в среду расширения NK-клеток с добавлением 50 единиц на миллилитр интерлейкина-2 и интерлейкина-15. Добавьте к NK-клеткам облученные искусственные APC в соотношении один к одному и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.
Для начала включите проточный цитометр. Оцените экспрессию рецептора активации NK на NK-клетках, полученных из анти-GPC3 CAR iPSC, чтобы определить активность и статус созревания клеток CAR-кейса. Для анализов на каспазу-3/7.
Подсчитайте целевые клетки в NK-клетках, полученных из GPC3 CAR iPSC, и предварительно окрашивайте их красителем CellTrace Violet в конечной концентрации пяти микромоляров в PBS под световой защитой в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия. Промойте клетки-мишени в полной питательной среде перед совместным культивированием с NK-клетками, полученными из CAR iPSC, при различных соотношениях эффекторов и мишеней при 37 градусах Цельсия. После трех часов и 30 минут совместного проживания.
Добавьте зеленый реактив для детектирования Каспазы-3/7 и выдерживайте еще 30 минут. Добавьте раствор для окрашивания мертвых клеток SYTOX в течение последних пяти минут окрашивания и аккуратно перемешайте. Проанализируйте окрашенные клетки с помощью проточной цитометрии.
Формирование спиновых БЭ из ИПК, спроектированных GPC3 CAR, наблюдалось на шестой день. Подтверждение ранней дифференцировки. Дифференцированные естественные киллеры или NK-клетки из GPC3 CAR IPC показали четкую морфологию на различных стадиях с третьего по 28-й день.
Проточный цитометрический анализ демонстрирует экспрессию гемопоэтических антигенов CD34 и CD31, а также небольшого количества CD43, но еще не экспрессирующего CD45 как в диком типе, так и в полученных от GPC3 CAR иПСК на шестой день. В каждом конкретном случае маркеры были обнаружены у зрелого дикого типа в NK-клетках, полученных из GPC3 CAR iPSC, на 35-е сутки. Подтверждение успешной дифференцировки в NK-клетки.
Расширенные клетки дикого типа и анти-GPC3 CAR iPSC, полученные из NK-клеток, демонстрировали различные маркеры активации, демонстрируя созревание NK-клеток. Экспрессия антигена GPC3 была подтверждена на опухолевых клеточных линиях с помощью проточной цитометрии, подтвердив целевую специфичность для NK-клеток, полученных из анти-GPC3 CAR iPSC. Анти GPC3 CAR iPSC NK-клетки продемонстрировали более высокую цитотоксическую активность в отношении GPC3, экспрессирующих клеточные линии HepG2, SNU-449, CAL 27 и SKOV3 по сравнению с клетками дикого типа iPSC NK.
