Объективный лабораторный метод, представленный здесь, может помочь изучить реакцию контактной гиперчувствительности у мышей, которая имитирует аллергический контактный дерматит у человека. Реакцию контактной гиперчувствительности можно измерить не только по отеку уха, но и по различным лабораторным тестам, позволяющим изучить клеточные механизмы, участвующие в этой реакции. Модель гиперчувствительности в более контактном состоянии может тестировать различные факторы окружающей среды и новые вещества, чтобы показать, модулируют ли тестируемые факторы Т-клеточно-зависимые иммунные реакции, что может быть использовано для реализации новых методов лечения.
Начните с бритья кожи мыши лезвием бритвы и маркировки лапы. За шесть часов до индукции контактной гиперчувствительности, или CHS, нанесите серое мыло с водой и побрейте двухсантиметровую квадратную область на груди и животе мыши. В тот же день сенсибилизируйте мышей, нанеся 150 микролитров свежеприготовленного 5% гаптена на ранее выбритое место.
В управляющей мыши применяйте только транспортное средство. Высушите пятно в течение 30 секунд, прежде чем поместить животное обратно в клетку. На четвертый день измерьте толщину уха мыши, находящейся под наркозом, с помощью микрометра в нулевой час наблюдателем, не знающим об экспериментальных группах.
Затем нанесите 10 микролитров свежеприготовленного 04%-ного гаптена на обе стороны ушей в тестовой и контрольной группах и дайте ему высохнуть в течение 30 секунд. На пятый день, через 24 часа после предыдущего применения 0,4% гаптена, повторите измерение толщины уха для 24-часового измерения. Через 24 часа после измерения толщины уха, когда мышь все еще находится под глубоким наркозом, отрежьте уши как можно ближе к черепу с помощью ножниц.
На дистальной стороне ушей сделайте пуансон диаметром шесть миллиметров с помощью пуансона для биопсии. Измерьте вес каждой биопсии уха на аналитических весах и выразите его в миллиграммах. Для анализа миелопероксидазы, или MPO, поместите биопсию уха в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку с шариками из нержавеющей стали и добавьте 500 микролитров подготовленного буфера.
Гомогенизируют биопсию в течение 10 минут в гомогенизаторе, а затем охлаждают образец в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия, прежде чем снова гомогенизировать его в течение 10 минут. Выньте шарики после гомогенизации биопсии. Заморозьте гомогенаты при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Разморозьте и встряхните образцы и повторите процедуру гомогенизации и замораживания три раза. После этого центрифугируйте гомогенат при температуре 3 000 г в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Соберите надосадочную жидкость с помощью пипетки, чтобы измерить активность MPO, и экспрессируйте ее в единицах на один миллиграмм белка.
Чтобы выполнить тест на проницаемость сосудов, сенсибилизируйте мышей на нулевой день, а на четвертый день непосредственно бросайте вызов, нанося гаптен на уши, используя ранее упомянутую процедуру. Через 23 часа внутривенно вводят 8,3 микролитра на грамм массы тела 1% синего красителя Эванса в фосфатном буферном физиологическом растворе Дульбекко, или DPBS, анестезированной мыши. Через час снова обезболите мышь, чтобы собрать биопсию уха, как описано ранее.
Чтобы извлечь краситель из ткани, инкубируйте биопсию в пробирках, содержащих один миллилитр формамида, при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере 5% углекислого газа в течение 18 часов. После сбора биопсии уха, когда мышь еще находится под глубоким наркозом, удалите глазное яблоко пинцетом. Слегка надавите на мышь и соберите кровь из ретроорбитального синуса в пробирку для сбора сыворотки.
Переверните пробирку шесть раз и подождите 30 минут, пока кровь не свернется. Затем центрифугируют пробирку при температуре от 1 300 до 2 000 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Сенсибилизируйте мышей-доноров гаптеном TNCB на нулевой день, используя ранее упомянутую процедуру. На четвертый день, после дезинфекции кожи, изолируйте подмышечные и паховые лимфатические узлы, или ALN, от анестезированной мыши с помощью щипцов, а затем изолируйте селезенку.
Разомните ткань между матовыми концами двух предметных стекол микроскопа и пропустите клеточную суспензию через клеточное ситечко с размером пор 70 микрометров. Затем промойте клетки DPBS с добавлением 1% эмбриональной бычьей сыворотки и центрифугируйте их при 300 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте оставшуюся клеточную гранулу в одном-пяти миллилитрах DPBS.
Приготовьте смесь АЛН и селезенки в соотношении 1:1 для достижения концентрации до 7,0 раз от 10 до седьмых клеток в 200 микролитрах DBPS перед внутривенным введением смеси CHS-эффекторных клеток анестезированной мыши. Измерьте толщину уха через нулевой час и через 24 часа после испытания. Данные показали, что у мышей, сенсибилизированных к TNCB и получивших вызов в ушах четыре дня спустя, значительно увеличился отек уха по сравнению с симуляцией сенсибилизации, а затем с аналогичным вызовом контрольных мышей.
Увеличение отека уха в испытуемой группе приводило к увеличению массы уха, активности МПО, концентрации гамма-интерферона в экстрактах уха, отечным изменениям дермы при гистологическом исследовании, проницаемости сосудов уха TNP-специфические антитела IgG1 были повышены в сыворотках тестовых мышей по сравнению с контрольными животными. Животные, которые получали CHS-эффекторные клетки от доноров, ранее сенсибилизированных TNCB, показали значительно увеличенный отек ушей по сравнению с животными, которые не получали клетки. Наиболее критическим моментом является запуск контактной гиперчувствительности.
Раствор гаптена очень летучий и светочувствительный, поэтому его необходимо быстро наносить на кожу животных. Дополнительные тесты могут быть проведены на изолированных эффекторных клетках. Например, клеточные культуры могут быть созданы для оценки способности к пролиферации в присутствии антигенов.
