Раковые клетки обладают замечательной способностью усваивать питательные вещества, такие как АТФ, из внеклеточной среды. Наш протокол позволяет нам продемонстрировать интернализацию АТФ и визуализировать локализацию АТФ внутри клеток. Эта визуализация с высоким разрешением интернализованной АТФ в макропинозомах идеально подходит для понимания особой локализации и завершения анализа интернализации.
Протокол описывает различные экспериментальные приложения для изучения интернализации АТФ. Этот метод может быть использован для изучения различных механизмов клеточной интернализации, включая макропиноцитоз и экзосомно-опосредованный эндоцитоз. Для метаболических заболеваний интернализация АТФ в не раковых клетках может быть изучена с помощью этого протокола.
Для начала посейте раковые клетки в колбу площадью 225 квадратных сантиметров, содержащую DMEM, дополненную FBS и антибиотиками. Позвольте клеткам расти при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в инкубаторе клеточной культуры. Как только 80%-ное слияние достигнуто, отделите клетки и гранулируйте отсоединенные ячейки путем центрифугирования и повторно суспендируйте клетки в ледяном PBS для достижения плотности клеток в 5 раз 10 до 6 клеток на 100 микролитров PBS.
Перенесите клеточную суспензию в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Очистите место инъекции на боку иммунодефицитной мыши, с 75% этанолом, и протрите избыток этанола деликатной салфеткой. Втяните ячейки в шприц без латекса на один миллилитр, оснащенный прецизионной скользящей иглой 27 калибра.
Для подкожной инъекции держите иглу под углом около 10 градусов к коже и вставьте кончик иглы со скосом, обращенным вверх под кожей, сохраняя только один-два миллиметра иглы вне кожи. Дозируйте клетки из шприца медленно в течение примерно 10 секунд. После введения всего объема удерживайте иглу на месте в течение трех-пяти секунд, а затем выньте иглу.
Нанесите мягкое, но твердое давление на место инъекции в течение трех-пяти секунд пальцами, чтобы предотвратить утечку введенного содержимого. Контролируйте и измеряйте рост опухоли с помощью суппортов Вернье, пока опухоли не достигнут объема от 200 до 500 кубических миллиметров. Растворите 300 микролитров по 16 миллиграммов на миллилитр высокомолекулярного флуоресцентного декстрана и бессывороточного DMEM и инкубируйте на водяной бане, закаленной при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, затем центрифугируйте раствор декстрана и перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.
При 40 микролитрах один миллимолярный негидролизуемый флуоресцентный аналог АТФ на 160 микролитра безсывороточного DMEM, чтобы получить 0,2 миллимолярный негидролизуемый флуоресцентный раствор АТФ. Готовят лечебные растворы ДМЭМ или восьми миллиграммов на миллилитр высоко- или низкомолекулярного флуоресцентного декстрана, с или без 100 микромолярного негидролизуемого флуоресцентного АТФ в ДМЭМ, путем смешивания исходных растворов, приготовленных ранее. Используйте один миллилитр шприца, чтобы собрать 50 микролитров одного лечебного раствора.
Вводят раствор непосредственно в опухоль ксенотрансплантата и повторяют в течение четырех биологических реплик каждого лечения. После усыпления мыши и выделения опухолевой ткани используйте перфорированную ложку, чтобы зачерпнуть резецированную опухолевую ткань и сразу же поместить ткань в морозильную среду и свернуть ткань, гарантируя, что ткань остается погруженной в среду ванн, все поверхности ткани. Осторожно поместите ткань во встраиваемую форму, содержащую морозильную среду.
Поместите соответствующую этикетку вертикально в морозильную среду или форму, гарантируя, что написанная этикетка видна снаружи среды. Когда морозильная среда станет непрозрачной белой, удалите блок ткани из формы, поместите блок тканей на сухой лед и повторите замораживание для каждого участка опухоли. Храните тканевые блоки при минус 80 градусах Цельсия в течение нескольких месяцев перед процедурой криосекции.
После изготовления слайдов тканевых блоков зафиксируйте срез тканей в 95% этаноле при минус 18 градусах Цельсия в течение пяти минут. Промывайте неподвижную секцию PBS в течение пяти минут. Добавьте от 10 до 50 микролитров водной монтажной среды с DAPI к участкам ткани, в соответствии с размером секций, и поместите стеклянную крышку поверх среза ткани.
После 12-24 часов монтажа определите области, представляющие интерес для фиксированных участков опухоли, и получите изображения с помощью флуоресцентной микроскопии, как показано ранее. После двух-24 часов фиксации опухолевых клеток человека и стояния с DAPI, захватите изображения с помощью эпифлуоресцентной системы визуализации и программного обеспечения для сбора данных. Поместите слайд на ступень вертикального эпифлорного микроскопа в бинокулярном режиме.
Откройте программу обработки изображений, выберите 10-кратную цель и отрегулируйте стадию для определения фокуса. Сканируйте слайд слева направо серпантином, чтобы определить интересующие области. Выберите объектив 40 раз и используйте переключатель на микроскопе, чтобы переключиться из бинокля в режим захвата изображения.
Нажмите на значок живого качества, чтобы просмотреть и впоследствии получить изображения. Используйте панель OC на панели сбора данных для определения параметров экспозиции для каждого куба фильтра или флуоресцентного канала, а затем используйте многоканальную панель сбора данных для получения трехканального изображения с заданными параметрами экспозиции. В качестве альтернативы, многоканальные изображения могут быть получены вручную путем переключения между кубами фильтра, установки времени экспозиции, закрытия или открытия затвора между получением изображения для каждого канала и наложения каждого изображения, сделанного для отдельных каналов.
Сохраните изображение как файл nd2. Сохраните файлы TIF, включая объединенное изображение канала и отдельные изображения канала. Используйте функцию подсчета объектов на панели инструментов аннотаций и измерений для подсчета количества NHF-ATP, TMR высокомолекулярного флуоресцентного декстрана и низкомолекулярных флуоресцентных декстран-положительных клеток TMR в сохраненном файле изображения nd2 и экспортируйте данные в электронную таблицу через программу анализа.
Данный протокол разработан для пространственного, временного и количественного анализа клеточной интернализации негидролизуемых АТФ. Внутриклеточная интернализация негидролизуемого флуоресцентного АТФ была продемонстрирована путем колокализации негидролизуемого флуоресцентного АТФ с высоко- или низкомолекулярным флуоресцентным декстраном in vitro, ex vivo и in vivo. Чтобы гарантировать, что опухолевые клетки сохранили интернализованную АТФ, ограничили экспериментальное время для всех внутриопухолевых инъекций криоинстиграции.
Также учитывают внутриопухолевые вариации путем визуализации ткани по всей опухоли. Будущие итерации нашего метода могут включать визуализацию процесса интернализации E-ATP в режиме реального времени, раскрывая информацию о макропиноцитотической кинетике и трафике в конкретных тканях.
