Рак области головы и шеи становится все более распространенным явлением. Тем не менее, существует ограниченное понимание микроокнивности опухоли и механизмов сопротивления лечения в этом регионе. Этот метод может быть использован для повторения родной микроокниронии опухолей головы / шеи в доступной форме и производит клинические проявления, аналогичные тем, которые видели в организме человека.
Когда культура опухолевых клеток достигла 70% слияния, мыть клетки три раза с холодной PBS за стирку и прикрепить клетки с достаточно 0,25%трипсина, чтобы покрыть нижнюю поверхность культуры колбы. После трех-четырех минут в инкубаторе клеточной культуры, подтвердите отслоение под легким микроскопом и нейтрализуйтесь трипсином с помощью 12 миллилитров среды DMEM F12, дополненной сывороткой крупного рогатого скота плода. Перенесите подвеску клетки в 50 миллилитровую коническую трубку и смешайте клетки три-четыре раза инверсией.
Затем соберите клетки путем центрифугации и повторно приостановить гранулы в сыворотке крови и без антибиотиков DMEM в один раз от 10 до шестой опухолевых клеток на 50 микролитров средней концентрации на льду. Непосредственно перед инъекцией, смешать клетки на один к одному опухолевых клеток подвески в подвале мембраны матрицы соотношение на льду. Загрузите один 0,5 миллилитровый шприц, оснащенный иглой 23-го калибра со 100 микролитров клеток на животное-реципиент.
Поместите шприцы на лед и подтвердите отсутствие реакции на щепотку ноша в обезболивающей мыши. Затем вставьте иглу в правую или левую бускальную область через доступное открытое пространство по обе стороны рта, удерживая шприц параллельно бускальной области, пока он находится внутри полости рта, чтобы облегчить инъекцию полного объема 100 микролитров клеточной мембранной мембраны матрицы подвески в течение пяти секунд. Держите шприц на месте в течение еще пяти секунд, чтобы убедиться, что весь материал был введен перед снятием шприца осторожно.
Опухоли станут очень заметны примерно через неделю. Через неделю после инъекции используйте калиперы для измерения длины и ширины каждой опухоли, чтобы определить объем опухоли один-два раза в неделю. И измерить вес каждого животного, чтобы оценить влияние роста опухоли на кормление.
В соответствующей экспериментальной конечной точке используйте острые ножницы и тупые миппы, чтобы сделать разрез кожи через середину шеи. И вставьте ножницы мягко под кожу, покрывающую опухоль, чтобы создать воздушные карманы, нажав ножницы поперек и в кожу. После того, как кожа достаточно отделена от опухоли, акциз дренажных лимфатических узлов, чтобы избежать опухолевой ткани путают с наличием лимфатической ткани и прорезать границы опухоли, пока весь объем отделяется.
Чтобы обработать опухоль для анализа вниз по течению, разрежьте опухоль на кусочки размером от одного до двух миллиметров и поместите кусочки в 50 миллилитровую коническую трубку, содержащую коллагеназу три, ДНК один и ингибитор трипсина. После инкубации опухоли штук при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, с встряхивания каждые 10 минут, добавить 20 миллилитров HBSS в трубку и пройти подвески, содержащие опухоли штук через 70 микрометров залить нейлоновый ситечко. Используйте пятими миллилитровый шприц поршень пюре опухоли штук в ситечко и добавить дополнительные 10 миллилитров HBSS через ситечко.
Спин вниз клетки центрифугации. Повторно приостановить гранулы в два-три миллилитров красного буфера лиза крови с строгой пипетки, нейтрализации лиза с 20 миллилитров свежего HBSS после двух минут при комнатной температуре. Затем повторно приостановить клетки в дополнительные 20 миллилитров HBSS для другой центрифугации и процедить клетки через 40 микрометровый фильтр залить, чтобы удалить любые окончательные мусора из подвески опухолевых клеток.
Опухоли LY2 растут более высокими темпами, по сравнению с опухолями B4B8. И мышей, которые демонстрируют смещения челюсти быстро развивается потеря веса, из-за дисфагии. Медианное выживание у мышей LY2 также меньше половины, что наблюдается у опухолевых мышей B4B8.
Магнитно-резонансная томография опухолевых мышей показывает хорошо разграниченные опухоли, простирающиеся во внутренний слой буккаля слизистой оболочки, но не во язык или другие близлежащие органы. Гистологическое исследование показывает, что у всех опухоленосных мышей LY2 развивается плохо дифференцированная плоскоклеточная карцинома, в то время как у мышей с опухолями B4B8 развивается умеренно дифференцированная плоскоклеточная карцинома. Все опухолевые мыши LY2 также имеют гисто логически подтвержденный некроз, при этом большинство из них демонстрирует умеренный и тяжелый некроз.
В этом репрезентативном эксперименте, опухоль LY2 была собрана и обработана через три недели после инъекции опухолевых клеток бускальной области, как попродемонстрировано. CD45-положительные иммунные клетки составили 7,3% от общей популяции опухолевых клеток. CD11b-положительные миелоидные клетки представляли 37,8% всех CD45-положительных клеток, большинство из которых были определены как F480-положительные макрофаги, с небольшими популяциями нейтрофилов и миелоидных клеток супрессора также наблюдается.
Т-клетки составили 15,9% от CD45-положительной популяции иммунных клеток, 53,4% из которых были CD4-положительных FoxP3-положительных регуляторных Т-клеток. Естественные клетки-убийцы составляли менее 2% всех клеток CD45-положительных. Важно практиковать инъекции для того, чтобы развить уверенность и комфорт в проведении иглы и реципиента мыши и в разоблачении рот животного.
После успешного проведения процедуры могут быть проведены эксперименты, связанные с оценкой реакции опухоли на терапию или оценку внутренних и микроокниронных факторов опухоли. Этот метод проложил путь в разработке следователя инициированных клинических испытаний, оценки последствий сочетания лучевой терапии с анти-PL1 терапии у пациентов с раком головы и шеи.
