Эта процедура позволяет исследователям комаров легко решать проблему репродуктивной пригодности комаров на индивидуальном уровне. По сравнению с обычными методами, этот протокол значительно сокращает время, пространство и труд, необходимые для проверки плодовитости и плодовитости комаров на индивидуальном уровне. Начните с подготовки пластин для эксперимента по овипозиции.
Просверлите четыре-шесть отверстий на скважину в крышке пластины культуры 24 скважины с помощью бытовой дрели с 1,6-миллиметровым битом. За день до эксперимента промойте и промойте тарелки и замочите их в 1%-5%bleach в течение 30 до 60 минут при комнатной температуре. Затем тщательно промойте тарелки под проточной деионизированной водой и высушите их.
Растопить 2%agarose в деионизированной воде и сразу же добавить 500 микролитров расплавленной агарозы в каждой хорошо 24-хорошо пластины. Оставьте тарелки на лабораторной скамейке на ночь, чтобы высушить конденсат. По крайней мере за 16 часов до кормления крови, удалить любой источник воды или сахара из самок комаров.
В день кормления нагревать циркулятор воды до 37 градусов по Цельсию и кормить комаров позвоночной кровью, помещаемой в искусственные фидерсы в течение 15-30 минут. Затем перенесите комаров в стеклянную тарелку на льду. Выберите те, которые engorged с кровью и поместите их в контейнер с 30%sucrose воды.
Разрешить по крайней мере 72 часов для женщин, чтобы закончить выделение и развитие яйцеклеток. Примерно за час до передачи комаров на 24-хорошо пластины, использовать передачу пипетки, чтобы добавить две-три капли воды в каждый колодец. Сбить комаров с углекислым газом и передать их в стеклянную тарелку на льду.
Затем по отдельности поместите каждого комара на перевернутую крышку пластины из 24 колодец. После того, как все 24 комаров были помещены, накройте крышку перевернутым дном пластины, закрестить его свежей новой резинкой и поместить его в экологическую камеру, пока комары восстановить. Затем поверните пластину вправо вверх.
Разрешить самкам комаров овипозит в течение 24 до 48 часов. Затем удалите самок, выпустив их из пластин в большую клетку. Прежде чем считать яйца, проверьте каждый хорошо для яиц, которые находятся на стенах хорошо и на краю агарозы и пластиковой поверхности, где они трудно решить на фотографиях.
Используйте влажную кисть, чтобы переместить эти яйца на плоскую поверхность, так что все яйца находятся в равномерной плоскости и не перекрывают друг друга. Используйте типсы, чтобы удалить любые сломанные ноги, крылья и другие частицы в колодцах, которые могут помешать изображению яиц. Установите компактную цифровую камеру в режиме микроскопа, которая позволяет пользователю сосредоточиться на объектах как можно ближе, чем один сантиметр и сделать снимок каждой хорошо.
После фотографирования каждого колодец пластины, возьмите изображение всей пластины. Используйте метку заказа изображений, чтобы отличить каждую пластину позже. Добавьте около пяти капель воды в каждую колодец, чтобы предотвратить его вилку агарозы и яйца от высыхания и вызвать развитие эмбриона и штриховки.
Перенесите изображения на компьютер и переименуйв файлы с табличкой и хорошо IDs для более простой организации. Откройте изображения с ImageJ и использовать многотясный инструмент, чтобы отметить каждое яйцо, масштабирование или выход, чтобы подсчитать яйца сгустки. После маркировки всех яиц, дважды нажмите значок Multi-point, чтобы принести вверх количество знаков и записать результаты в электронной таблице.
Начните добавлять пищу в колодцы, которые содержат вылупившихся личинок, как только они появляются. Примерно через пять-восемь дней обезболизывать личинки, покрывая пластину дробленым льдом в течение 15-20 минут. Вставьте черный материал под пластиной для повышения контрастности и принимать изображения каждого хорошо, сохраняя пластины на льду.
После фотографирования каждого колодец, сделай изображение всей пластины с этикеткой заказа изображений. Откройте изображения с ImageJ и используйте многотасный инструмент для подсчета личинок. Личинки могут различаться по форме, углу и фокусу.
Исключите кутикулы сарая, которые смотрят как голов-только личинки с немного тела, или сморщенные личинки. Запись результатов в таблице. Комары были введены с двуестной РНК ориентации кандидата транспортер железа, FeT, или контрольный ген, EGFP.
Затем, они были сыты по крови и измеряется для плодовитости и плодородия выход с помощью метода eagle пластины. Комары, в которых выражение железного транспортера замолчали, продемонстрировали значительное сокращение как количества яиц, так и скорости вылупления. FeT-молчание комаров также выставлены задержки выделения и малых и светлых яиц.
Принимая хорошие фотографии является важным шагом для этого метода, потому что качество фотографий и количество отдельных яиц или личинок непосредственно влияют на качество результатов.
