Questa procedura consente ai ricercatori di zanzare di affrontare facilmente la forma fisica riproduttiva delle loro zanzare a livello individuale. Rispetto ai metodi convenzionali, questo protocollo riduce significativamente il tempo, lo spazio e il lavoro necessari per testare la fecondità e la fertilità delle zanzare a livello individuale. Inizia preparando le lastre per l'esperimento di ovideposizione.
Praticare da quattro a sei fori per pozzo nel coperchio di una piastra di coltura da 24 pozzetto utilizzando un trapano domestico con un bit di 1,6 millimetri. Un giorno prima dell'esperimento, lavare e risciacquare i piatti e immergerli in candeggina dall'1% al 5% per 30-60 minuti a temperatura ambiente. Quindi, sciacquare accuratamente le piastre sotto l'acqua deionizzata corrente e asciugarle.
Sciogliere il 2% di agarosio in acqua deionizzata e aggiungere immediatamente 500 microlitri dell'agarosio fuso a ciascun pozzo di una piastra di 24 pozzi. Lasciare le piastre sulla panchina del laboratorio durante la notte per asciugare qualsiasi condensa. Almeno 16 ore prima dell'alimentazione del sangue, rimuovere qualsiasi fonte di acqua o zucchero dalle zanzare femminili.
Il giorno dell'alimentazione, riscaldare un circolatore d'acqua a 37 gradi Celsius e nutrire le zanzare con sangue vertebrato posto in alimentatori artificiali per 15-30 minuti. Quindi, trasferisci le zanzare in un piatto di vetro sul ghiaccio. Selezionare quelli ingoiati dal sangue e metterli in un contenitore con acqua di saccarosio al 30%.
Lasciare almeno 72 ore alle femmine per finire escrezione e sviluppo delle uova. Circa un'ora prima di trasferire le zanzare nella piastra da 24 pozze, utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere da due a tre gocce d'acqua in ogni pozzo. Abbatti le zanzare con anidride carbonica e trasferiscile in un piatto di vetro sul ghiaccio.
Quindi, posizionare individualmente ogni zanzara su un coperchio rovesciato del piatto da 24 pozzi. Una volta posizionate tutte le 24 zanzare, coprire il coperchio con un fondo piatto rovesciato, fissarlo con un nuovo elastico fresco e posizionare in una camera ambientale fino a quando le zanzare non si riprendono. Quindi, ruotare il lato destro della piastra verso l'alto.
Lasciare che le zanzare femminili ovoposit per 24-48 ore. Quindi, rimuovere le femmine rilasciandole dai piatti in una grande gabbia. Prima di contare le uova, controllare ognuna bene le uova che si trovano sulle pareti del pozzo e a margine dell'agarosio e della superficie di plastica dove sono difficili da risolvere nelle fotografie.
Utilizzare un pennello bagnato per spostare queste uova sulla superficie piana in modo che tutte le uova si trovano su un piano uniforme e non si sovrappongano. Utilizzare le forcep per rimuovere eventuali gambe rotte, ali e altre particelle nei pozzi che possono interferire con l'imaging delle uova. Imposta una fotocamera digitale compatta in modalità microscopio, che consente all'utente di concentrarsi su oggetti vicini a un centimetro e scattare un'immagine di ogni pozzo.
Dopo aver fotografato ogni pozzo di un piatto, scatta un'immagine dell'intero piatto. Utilizzare un'etichetta dell'ordine di imaging per distinguere ogni lastra in un secondo momento. Aggiungere circa cinque gocce d'acqua a ciascun pozzo per evitare che il suo tappo di agarosio e le uova si asciughino e per indurre lo sviluppo e la schiusa dell'embrione.
Trasferire le immagini in un computer e rinominare i file con la piastra e gli ID pozzo per un'organizzazione più semplice. Aprite le immagini con ImageJ e usate lo strumento Multi-point per contrassegnare ogni uovo, ingrandindo o rimpipigliando per contare i grumi di uova. Dopo aver segnato tutte le uova, fare doppio clic sull'icona Multi-point per riportare il numero di indicatori e registrare i risultati in un foglio di calcolo.
Inizia ad aggiungere cibo ai pozzi che contengono larve tratteggiate non appena appaiono. Circa cinque o otto giorni dopo, anestetizza le larve coprendo il piatto con ghiaccio schiacciato per 15-20 minuti. Inserire un materiale nero sotto la piastra per migliorare il contrasto e scattare immagini di ogni pozzo mantenendo le piastre sul ghiaccio.
Dopo aver fotografato ogni pozzo, scatta un'immagine dell'intera lastra con un'etichetta dell'ordine di imaging. Aprite le immagini con ImageJ e utilizzate lo strumento Multi-point per contare le larve. Le larve possono variare per forma, angolo e messa a fuoco.
Escludi le cuticole del capannone, che sembrano larve solo per la testa con un po 'di corpo o larve rimpicciolite. Registrare i risultati nel foglio di calcolo. Alle zanzare è stato iniettato RNA a doppio filamento che prende di mira un trasportatore di ferro candidato, FeT, o un gene di controllo, EGFP.
Quindi, sono stati nutriti con sangue e misurati per la fecondità e la produzione di fertilità usando il metodo della piastra eagle. Le zanzare in cui l'espressione del trasportatore di ferro è stata silenziata hanno mostrato una significativa riduzione sia del numero di uova che del tasso di schiusa. Le zanzare silenziate dal FeT mostravano anche escrezioni ritardate e uova piccole e di colore chiaro.
Scattare buone foto è un passo fondamentale per questo metodo perché la qualità delle immagini e la quantità di singole uova o larve influenzano direttamente la qualità dei risultati.
