Este procedimiento permite a los investigadores de mosquitos abordar fácilmente la aptitud reproductiva de sus mosquitos a nivel individual. En comparación con los métodos convencionales, este protocolo reduce significativamente el tiempo, el espacio y el trabajo necesarios para probar la fecundidad y fertilidad de los mosquitos a nivel individual. Comience preparando placas para el experimento de oviposición.
Perfore de cuatro a seis agujeros por pozo en la tapa de una placa de cultivo de 24 pozos utilizando un taladro doméstico con una broca de 1,6 milímetros. Un día antes del experimento, lave y enjuague los platos y remoje en 1% a 5% de lejía durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente. Luego, enjuague bien las placas con agua desionizada corriente y séquelas.
Derrita 2% de agarosa en agua desionizada e inmediatamente agregue 500 microlitros de la agarosa fundida a cada pozo de una placa de 24 pozos. Deje las placas en el banco de laboratorio durante la noche para secar cualquier condensación. Al menos 16 horas antes de la alimentación con sangre, retire cualquier fuente de agua o azúcar de los mosquitos hembra.
El día de la alimentación, calentar un circulador de agua a 37 grados centígrados y alimentar a los mosquitos con sangre de vertebrados colocados en comederos artificiales durante 15 a 30 minutos. Luego, transfiera los mosquitos a un plato de vidrio sobre hielo. Seleccione los que están llenos de sangre y colóelos en un recipiente con agua de sacarosa al 30%.
Deje al menos 72 horas para que las hembras terminen la excreción y el desarrollo del huevo. Aproximadamente una hora antes de transferir los mosquitos a la placa de 24 pozos, use una pipeta de transferencia para agregar de dos a tres gotas de agua en cada pozo. Derriba los mosquitos con dióxido de carbono y transfiéntelos a un plato de vidrio sobre hielo.
Luego, coloque individualmente cada mosquito en una tapa invertida de la placa de 24 pozos. Una vez que se hayan colocado los 24 mosquitos, cubra la tapa con un fondo de placa invertido, asegure con una nueva banda elástica fresca y colótela en una cámara ambiental hasta que los mosquitos se recuperen. Luego, gire la placa hacia arriba.
Deje que los mosquitos hembra se ovipositar durante 24 a 48 horas. Luego, retire las hembras liberándolas de las placas en una jaula grande. Antes de contar los huevos, revise cada pozo para ver si hay huevos que están en las paredes del pozo y en el margen de la superficie de la agarosa y el plástico donde son difíciles de resolver en las fotografías.
Use un pincel húmedo para mover estos huevos a la superficie plana para que todos los huevos estén en un plano uniforme y no se superpongan entre sí. Use pórceps para eliminar las patas rotas, las alas y otras partículas en los pozos que puedan interferir con los huevos de diagnóstico por imágenes. Configure una cámara digital compacta en modo microscopio, lo que permite al usuario enfocar objetos tan cercanos a un centímetro y tomar una imagen de cada pozo.
Después de fotografiar cada pozo de una placa, tome una imagen de toda la placa. Utilice una etiqueta de orden de imágenes para distinguir cada placa más adelante. Agregue unas cinco gotas de agua a cada pozo para evitar que su tapón de agarosa y los huevos se sequen e inducir el desarrollo y la eclosión del embrión.
Transfiera las imágenes a una computadora y cambie el nombre de los archivos con la placa y los identificadores de pozo para una organización más fácil. Abra las imágenes con ImageJ y use la herramienta multipunto para marcar cada huevo, acercando o alejando para contar los grupos de huevos. Después de marcar todos los huevos, haga doble clic en el icono Multipunto para mostrar el número de marcas y registrar los resultados en una hoja de cálculo.
Comience a agregar alimento a los pozos que contienen larvas eclosionadas tan pronto como aparezcan. Aproximadamente cinco a ocho días después, anestesiar las larvas cubriendo la placa con hielo triturado durante 15 a 20 minutos. Inserte un material negro debajo de la placa para mejorar el contraste y tome imágenes de cada pozo mientras mantiene las placas en el hielo.
Después de fotografiar cada pozo, tome una imagen de toda la placa con una etiqueta de orden de imágenes. Abra imágenes con ImageJ y use la herramienta multipunto para contar las larvas. Las larvas pueden variar en forma, ángulo y enfoque.
Excluya las cutículas de la vertiente, que parecen larvas de cabeza solamente con un poco de cuerpo, o larvas encogidas. Registre los resultados en la hoja de cálculo. Los mosquitos fueron inyectados con arn de doble cadena dirigido a un transportador de hierro candidato, FeT, o un gen de control, EGFP.
Luego, fueron alimentados con sangre y medidos para la fecundidad y la producción de fertilidad utilizando el método de la placa de águila. Los mosquitos en los que se silenció la expresión del transportador de hierro exhibieron una reducción significativa tanto en el número de huevos como en la tasa de eclosión. Los mosquitos silenciados por FeT también exhibieron excreción retardada y huevos pequeños y de colores claros.
Tomar buenas fotos es un paso crítico para este método porque la calidad de las imágenes y la cantidad de huevos o larvas individuales afectan directamente la calidad de los resultados.
