Модифицированная РНК является новым методом передачи генов в сердце и другие органы. Этот протокол обеспечит точный подход доставки желаемых генов преходяще к сердцу, после инфаркта миокарда. Этот метод не ограничивается инфарктом миокарда, но также может быть применен к реперфузии и поперечным моделям сужения аорты.
Модифицированная РНК используется в нескольких клинических испытаниях на людях. Тем не менее, нет стандартизированного протокола для гена, переданного в сердце с помощью этого метода. Визуальная демонстрация позволит исследователям правильно вводить модифицированную РНК в соответствующих местах в сердце.
Демонстрация procedule будет Ajit Magadum, постдокторант, и Елена Чепурко животных руководитель из нашей лаборатории. На основе концентрации ранее подготовленной на модРНК, рассчитать объем модРНК, необходимых для 100 микрограмм инъекций. Делает равные объемы сахарозы и цитратных растворов.
Затем добавьте рассчитанный объем модРНК и достаточное физраствор, чтобы довести объем инъекций до 60 микролитров. После анестезии животное, поместите его брюшной стороны вверх, с его рот лицом к экспериментатору. Затем для поддержания открытых дыхательных путей, выполняя интратрахеальной инутубации, осторожно вытащить язык.
Отрегулируйте угол шеи, чтобы выпрямить путь инубации, и нажмите в канюле intubation. Наблюдайте грудное движение мыши, чтобы убедиться, что оба легких получают кислород. Частота дыхания должна быть около 120 вдохов в минуту.
Чтобы начать перевязку LAD, поверните мышь осторожно на правую сторону. поднимите кожу и выполните левостороннюю торакотомию между третьим и четвертым ребрами. Откройте грудную клетку осторожно, не касаясь легких острыми предметами.
Поместите втягиватели в разрез, чтобы держать грудную полость открытой, обеспечивая четкое представление о сердце. Затем перемести легкие к краю разреза и удалите часть перикардиального мешка, закрываюющего сердце. Тщательно определите LAD, глубокий свет красный сосуд, расположенный между легочной артерии и левой асикулы.
Ligate проксимальный LAD с одним шелковым швом. Используя инсулиновый шприц, доставь в общей сложности 60 микролитров раствора модРНК в сердце. Вводите 20 микролитров внутримышечно, на трех разных участках.
Один участок по обе стороны перевязки и один в вершине сердца. Лучший способ ввести модифицированную РНК в правильных местах, это наблюдать обесцвечивание ткани под микроскопом, после окклюзии LAD. Кроме того, при введении, не углубляться в ткани, чтобы достичь сердца камер в кровообращение.
Закройте грудной разрез слоями. Первое использование было 6-0 шелковых швов для адаптации ребер. Затем используйте 5-0 шелковых швов, чтобы закрыть кожу.
Для фазы восстановления, удалить канюлю, и позволяют спонтанное дыхание. Поместите животное на грелку, пока оно не приходит в сознание. Не оставляйте животное без присмотра до полного бодрствования.
Чтобы справиться с постхирургической болью, вводите бупренорфин подкожно с интервалом в 12 часов в течение трех дней. При дозе 0,1 миллиграмма на килограмм массы тела. Через 24 часа после перевязки LAD и инъекции люциферазы модРНК у мышей CFW, трансфекция была проверена путем проверки экспрессии белка люциферазы с помощью системы биолюминесценции изображения.
Сигнал люциферазы может быть четко обнаружен на изображениях, сравнивающих контрольных мышей, с мышами, введенными с люциферазой modRNA. Количественная оценка сигнала люциферазы показывает значительно более высокую экспрессию белка у обработанных мышей, чем у контрольных мышей. Выражение Cre modRNA было подтверждено проверкой его перевода и биораспределеем у трансгенных мышей ROSA26 mTmG.
Через 24 часа после операции и cre modRNA инъекции, искусства были зафиксированы и обработаны для иммуностинтирования с кардиомиоцитов маркер, сердечный тропонин I, и ядра маркер DAPI. Успешное выражение cre было очевидно из-за появления зеленых цветных кардиомиоцитов. На слитом изображении показаны активированные ячейки вокруг двух видимых мест инъекций.
Синий - это ядерное пятно DAPI. Модифицированная РНК-платформа может обеспечить единую комбинацию генов или генов в различных органах. И таким образом может быть использован в терапевтических целях, таких как исправление генетических расстройств, или активации полезных механизмов в организме.
Уникальная фармакокинетика модифицированной РНК позволяет оценить функцию гена сразу после его инъекции. Это позволяет исследователю ориентировать сигнальные пути, которые изменяются в первые несколько часов инфаркта.
