RNA modificado é um novo método para transferência de genes para o coração, e outros órgãos. Este protocolo fornecerá uma abordagem precisa de entregar genes desejados transitoriamente ao coração, após infarto do miocárdio. Este método não se limita ao infarto do miocárdio, mas também pode ser aplicado à reperfusão de isquemia e modelos de constrição aórtica transversal.
O RNA modificado está sendo usado em vários ensaios clínicos em humanos. No entanto, não há um protocolo padronizado para gene transferido para o coração usando este método. A demonstração visual permitirá que os pesquisadores injetem corretamente o RNA modificado em locais apropriados do coração.
Demonstrando o procedule estarão Ajit Magadum, pós-doutorando, e Elena Chepurko, supervisora de animais do nosso laboratório. Com base na concentração do previamente preparado no modRNA, calcule o volume de modRNA necessário para uma injeção de 100 microgramas. Faz volumes iguais de sacarose e soluções de citrato.
Em seguida, adicione o volume calculado de modRNA, e solução salina suficiente para trazer o volume de injeção para 60 microliters. Depois de anestesiar o animal, coloque-o de lado ventral para cima, com a boca voltada para o experimentador. Em seguida, para manter uma via aérea aberta realizando intubação intratraqueal, puxe suavemente a língua.
Ajuste o ângulo do pescoço para endireitar o caminho da intubação e empurre na cânula de intubação. Observe o movimento torácico do camundongo para verificar se ambos os pulmões estão recebendo oxigênio. A taxa respiratória deve ser de aproximadamente 120 respirações por minuto.
Para iniciar a ligadura LAD, gire o mouse cuidadosamente para o lado direito. levantar a pele, e realizar uma toracotomia do lado esquerdo entre a terceira e quarta costelas. Abra o tórax cuidadosamente, sem tocar nos pulmões com objetos afiados.
Coloque os retráteis na incisão para manter a cavidade torácica aberta, proporcionando uma visão clara do coração. Em seguida, mova os pulmões para a borda da incisão, e remova a parte do saco pericárdico que está cobrindo o coração. Identifique cuidadosamente o LAD, um vaso vermelho de luz profunda, localizado entre a artéria pulmonar e a aurícula esquerda.
Ligate o LAD proximal com uma única sutura de seda. Usando uma seringa de insulina, entregue um total de 60 microliters da solução modRNA para o coração. Injete 20 microliters intramuscularmente, em três locais diferentes.
Um local em cada lado da ligadura e outro no ápice do coração. A melhor maneira de injetar o RNA modificado nos locais corretos, é observar a descoloração do tecido sob microscópio, após a oclusão de LAD. Também quando injetado, não vá muito fundo no tecido para alcançar as câmaras cardíacas na circulação.
Feche a incisão torácica em camadas. O primeiro uso foi 6-0 suturas de seda para adaptar as costelas. Em seguida, use suturas de seda 5-0 para fechar a pele.
Para a fase de recuperação, remova a cânula e permita a respiração espontânea. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento até que ele recupere a consciência. Não deixe o animal sozinho até que esteja totalmente acordado.
Para controlar a dor pós-úrgica, injete buprenorfina subcutânea em intervalos de 12 horas por três dias. A uma dose de 0,1 miligramas por quilograma de peso corporal. 24 horas após a ligadura LAD e a injeção de modRNA de luciferase em camundongos CFW, a transfecção foi validada verificando a expressão proteica da luciferase usando um sistema de imagem de bioluminescência.
O sinal de luciferase pode ser claramente detectado em imagens comparando ratos de controle, a ratos injetados com modRNA de luciferase. A quantificação do sinal de luciferase mostra expressão proteica significativamente maior em camundongos tratados do que em camundongos de controle. A expressão cre modRNA foi validada verificando sua tradução e distribuição biológica em camundongos TRANSGÊNICOs ROSA26 mTmG.
24 horas após a cirurgia e injeção de cre modRNA, as artes foram fixadas e processadas para imunossaturação com marcador cardiomiocócito, troponina cardíaca I e marcador de núcleos DAPI. A expressão cre bem sucedida ficou evidente devido ao aparecimento de cardiomiócitos de cor verde. Uma imagem mesclada mostra células ativadas por cre ao redor dos dois locais de injeção visível.
Azul é a mancha nuclear DAPI. A plataforma RNA modificada pode fornecer uma única combinação de genes ou genes em variedade de órgãos. E assim pode ser usado para fins terapêuticos, como corrigir distúrbios genéticos, ou ativar mecanismos benéficos no corpo.
A farmacocinética única do RNA modificado nos permite avaliar a função genética imediatamente após sua injeção. Isso permite que o pesquisador direja vias de sinalização, que são alteradas nas primeiras horas de infarto.
