С ПОМОЩЬю TRAP-seq мы можем изолировать РНК от определенных типов клеток, таких как гепатоциты, заселяющиеся в поврежденную печень, чтобы проанализировать изменения экспрессии генов, происходящие в этих клетках. Он не требует каких-либо шагов для удаления нежелательных клеток из ткани. Клеточная РНК, специфичная для клеток, изолирована от очищения сродства от лизолатов всего органа.
Этот метод помогает нам определить, как конкретные клетки реагируют на травмы, которые могли бы помочь определить новые стратегии или препараты для борьбы с заболеваниями печени. Это может быть использовано для определения того, как клетки печени реагировать на различные типы травм печени. В настоящее время Есть несколько вариантов для тяжелых острых травм печени, и этот метод поможет ключ нас к новым лечения.
Этот метод возник в головном мозге. В печени, мы предполагали, что он может быть использован для изучения динамических изменений в различных типах клеток, гепатоцитов, желчных клеток протоков, клеток Купфера, и эндотелиальных клеток, чтобы назвать несколько. Демонстрацией процедуры будет Эмбер Ван, аспирант и мой подоный.
Для начала, resuspend магнитные бусины нежным пипетки. Соберите бисер на магнитной подгоке в течение более одной минуты и удалить супернатант. Затем снимите трубку микроцентрифуга с магнитного стенда и добавьте один миллилитр PBS, а затем трубчатые вверх и вниз, чтобы вымыть бисер.
Поместите трубку обратно на магнитный стенд в течение более одной минуты, чтобы собрать бисер и удалить PBS. Для приготовления белка L-покрытие бисера, добавить 16 микролитров биотинилированного белка L в перерасход и промытые магнитные бусины и добавить 1X PBS, чтобы сделать окончательный объем один миллилитр, при использовании 1,5-миллилитровый микроцентрифуг трубки, или 1,5 миллилитров, при использовании двухмилилитровой микроцентрифуг трубки. Инкубировать магнитные бусы биотинилированным белком L в течение 35 минут при комнатной температуре на трубчатом ротаторе.
Затем поместите трубку на магнитный стенд в течение более одной минуты и удалите супернатант, чтобы собрать белок L-покрытые бисером. Удалите трубку микроцентрифуга с магнитного стенда и добавьте один миллилитр PBS с буфером 3%BSA, а затем нежный пипетки по крайней мере пять раз, чтобы вымыть белок L-покрытием бисера. Опять же, поместите трубку на магнитный стенд в течение более одной минуты и удалить супернатант, чтобы собрать покрытием бисера.
Повторите промывку BSA еще четыре раза. Затем добавьте 50 микрограммов антител к антителам GFP 19C8 и GFP антитела 19F7 каждый в белок L-покрытые бусины, и инкубировать в течение одного часа при четырех градусах цельсия на трубчатом ротаторе. Чтобы собрать матрицу сродства, поместите трубку на магнитный стенд более чем на одну минуту и удалите супернатант.
Возьмите трубку от магнитного стенда и добавьте один миллилитр низкосоленого буфера. Аккуратно трубят вверх-вниз, чтобы вымыть матрицу сродства и повторить низкосолевой буфер мыть еще два раза. Перезаполнить бисер в 200 микролитров низкосоленого буфера, чтобы сделать 200 микролитров матрицы сродства.
Во-первых, настроить ткань шлифовальной машины так, что PTFE стеклянные трубки могут быть размещены на льду во время гомогенизации. Заполните четыре миллилитров холодного лиза буфера в стеклянные трубки PTFE. Положите печень на чашку Петри.
Используйте нож, чтобы изолировать от 200 до 500 миллиграммов кусочков печени и перейти в PTFE стеклянные трубки. Поместите оставшуюся ткань печени в предварительно охлажденную микроцентрифугную трубку и заморозьте в жидком азоте. Гомогенизировать образцы в мотор-управляемый гомогенизатор, начиная с 300 об / мин, по крайней мере пять ударов, чтобы отмежеваться гепатоцитов от структуры печени.
Каждый раз опустите стеклянную трубку. Предотвратить аэрацию, которая может вызвать денатурацию белка, сохраняя пестик ниже раствора. Затем поднимите скорость до 900 об/мин, чтобы полностью гомогенизировать ткани печени, по крайней мере 12 полных ударов.
Перенесите лизат в помеченные и предварительно охлажденные трубки с не более чем одним миллилитром лизата каждый. Чтобы начать ядерныйлиз, центрифуга печени лизать на 2000 раз г при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут, а затем передать супернатант в новый предварительно охлажденный микроцентрифуг трубки на льду. Добавьте 1/9th из supernatant тома 10%NP-40 в пробку микроцентрифуга на льду и смешайте разрешение путем нежно инвертировать пробку.
Быстро спина вниз микроцентрифуг трубки с мини центрифугой и добавить 1/9th объема выборки 10%DOC. Смешайте, мягко инвертирование микроцентрифуг труб и быстро спина вниз микроцентрифуг труб и инкубировать на льду в течение пяти минут. Центрифуга ядерного лизатата на 20000 раз г при четырех градусах По Цельсию в течение 10 минут и передачи супернатанта в новые предварительно охлажденные микроцентрифуг трубки на льду.
Для каждой трубки вынюхив 1% от общего объема супернатанта в качестве контроля пре-иммунопреципиентации. Поместите преддеммупрессивный контроль на трубчатый ротатор при четырех градусах Цельсия за одну ночь. Позаботьтесь о дополнительной осторожностью, чтобы аккуратно повторно использовать матрицу сродства путем трубопроводов, а затем добавить 200 микролитров к каждому образцу.
Инкубировать лисаты при четырех градусах по Цельсию на ночь с нежным смешивания на трубчатом ротаторе. Чтобы изолировать РНК, быстро вращай трубки, содержащие лизоли в мини-центрифуге, и собирайте бисер, поместив на магнитную стойку, по крайней мере, на одну минуту. Соберите супернатант в дополнительных микроцентрифуговых трубках.
Добавьте один миллилитр свежего высокосоленого буфера в каждую трубку, а затем нежный трубчатый по крайней мере пять раз без введения пузырьков. Соберите бисер на магнитной подстоять на льду в течение одной минуты и удалить супернатант. Повторите шаги стирки еще четыре раза.
Затем снимите микроцентрифуг трубки с магнитного стенда и поместите при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы согреться. Перезапись бисера в 100 микролитров лиза буфера с 0,7 микролитров бета-меркаптоэтанола, чтобы освободить связанную РНК из матрицы сродства. Vortex труб, по крайней мере пять секунд на самой высокой скорости и быстро вращаться вниз.
Затем инкубировать трубки при комнатной температуре в течение 10 минут. Поместите трубки на магнитный стенд, по крайней мере одну минуту, а затем собрать супернатант и немедленно приступить к очистке РНК в соответствии с протоколом очистки РНК в комплекте. Для достижения максимального качества изолированной РНК выполните все дополнительные шаги, включая пищеварение DNase и все шаги по элюции РНК, включая рекомендуемое разогрев буфера элюции до 60 градусов по Цельсию.
В этом исследовании, GFP-L10A слияния и Фах трансгены были совместно доставлены в транспосон-содержащих плазмидных ловушки вектор печени путем гидродинамических инъекций. Удаление нитизинона вызвало токсичную травму печени. Иммунофлюоресценция окрашивания подтвердил коэкспрессии FAH и GFP-L10A синтез белка и перенаселения гепатоцитов после двух недель перенаселения печени.
В тихие образцы производится самый высокий выход синтеза белка, так как все гепатоциты выражают GFP-L10A после инъекции AAV8-TBG-Cre. И наоборот, практически ни одна РНК не была обнаружена в управлениях дикого типа, которые не имеют трансгена GFP-L10A, что указывает на то, что процедура TRAP является весьма специфической и имеет низкий фон. Когда TRAP был использован на ткани печени проходит перенаселение с GFP-L10A транс индуцированных гепатоцитов, обильные высококачественные РНК была получена.
В отличие от этого, никаких следов РНК не было обнаружено через Bioanalyzer для отрицательного образца контроля. Выражение Gsta1 было вызвано более чем десятикратным увеличением перенаселения гепатоцитов по сравнению с тихими гепатоцитами, в то время как значения порогового цикла не были обнаружены с помощью изолированной TRAP РНК от мыши дикого типа из-за отсутствия входной РНК. При гомогенизации ткани, убедитесь, что двигаться пестик медленно, чтобы предотвратить аэрацию.
После изоляции РНК для анализа экспрессии генов может быть выполнено секвенирование высокой пропускной способности или qPCR. С TRAP-seq, теперь у нас есть метод, чтобы конкретно изолировать РНК от перенаселения гепатоцитов и проанализировать изменения в экспрессии генов во время перенаселения печени. Это позволяет нам определить гены, которые изменяются в ходе этого процесса и потенциальных терапевтических целей для лечения травмы печени.
Циклохексимид и DTT, которые присутствуют в нескольких буферах, являются токсичными. Отходы должны собираться и выбрасываться в соответствии с институциональными руководящими принципами.
