Avec TRAP-seq, nous pouvons isoler l’ARN de types cellulaires spécifiques, tels que les hépatocytes qui se répulsent dans le foie blessé pour analyser les changements d’expression génétique qui se produisent dans ces cellules. Il ne nécessite aucune étape pour enlever les cellules indésirables du tissu. L’ARN spécifique au type cellulaire est isolé par purification par affinité des lysates d’organes entiers.
Cette technique nous aide à déterminer comment des cellules spécifiques réagissent aux blessures, ce qui pourrait aider à identifier de nouvelles stratégies ou médicaments pour lutter contre les maladies du foie. Cela pourrait être utilisé pour identifier comment les cellules hépatiques réagissent à différents types de lésions hépatiques. Actuellement, il y a peu d’options pour les dommages aigus graves de foie et cette méthode aidera à nous indice dans de nouveaux traitements.
Cette méthode est née dans le cerveau. Dans le foie, nous avons envisagé qu’il pourrait être utilisé pour examiner les changements dynamiques dans une variété de types de cellules, les hépatocytes, les cellules des conduits biliaires, les cellules Kupffer, et les cellules endothéliales pour n’en nommer que quelques-uns. Amber Wang, une étudiante diplômée et ma mentée, feront la démonstration de la procédure.
Pour commencer, resuspendez les perles magnétiques par pipetting doux. Recueillir les perles sur un support magnétique pendant plus d’une minute et enlever le surnatant. Ensuite, retirez le tube de microcentrifugeuse du support magnétique et ajoutez un millilitre de PBS, suivi d’un tuyautage de haut en bas pour laver les perles.
Remettre le tube sur le support magnétique pendant plus d’une minute pour recueillir les perles et retirer le PBS. Pour préparer les perles enrobées de protéines L, ajouter 16 microlitres de protéines biotinylées L aux perles magnétiques résuspendues et lavées et ajouter 1X PBS pour faire le volume final d’un millilitre, si vous utilisez un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, ou 1,5 millilitres, si vous utilisez un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres. Incuber les perles magnétiques avec de la protéine biotinylée L pendant 35 minutes à température ambiante sur un rotateur à tube.
Ensuite, placez le tube sur le support magnétique pendant plus d’une minute et retirez le supernatant pour recueillir les perles enrobées de protéines L. Retirer le tube de microcentrifugeuse du support magnétique et ajouter un millilitre de PBS avec tampon 3%BSA, suivi d’un tuyautage doux au moins cinq fois pour laver les perles enrobées de protéines L. Encore une fois, placez le tube sur le support magnétique pendant plus d’une minute et retirez le supernatant pour recueillir les perles enduites.
Répétez le lavage BSA encore quatre fois. Ensuite, ajoutez 50 microgrammes d’anticorps pour l’anticorps GFP 19C8 et l’anticorps GFP 19F7 chacun dans les perles enrobées de protéines L, et incubez pendant une heure à quatre degrés Celsius sur un rotateur à tube. Pour recueillir la matrice d’affinité, placez le tube sur le support magnétique pendant plus d’une minute et retirez le surnatant.
Éloignez le tube du support magnétique et ajoutez un millilitre de tampon à faible teneur en sel. Pipet doucement de haut en bas pour laver la matrice d’affinité et répéter le tampon à faible teneur en sel laver encore deux fois. Resuspendez les perles dans 200 microlitres de tampon à faible teneur en sel, pour faire 200 microlitres de matrice d’affinité.
Tout d’abord, installez le broyeur de tissu de sorte que les tubes en verre PTFE puissent être placés sur la glace pendant l’homogénéisation. Remplissez quatre millilitres de tampon de lyse froide dans les tubes en verre PTFE. Déposer le foie sur une boîte de Pétri.
Utilisez un couteau pour isoler 200 à 500 milligrammes de morceaux de foie et passer dans les tubes en verre PTFE. Placer le reste du tissu hépatique dans un tube de microcentrifugeuse pré-réfrigéré et congeler le flash dans de l’azote liquide. Homogénéiser les échantillons dans un homogénéiseur à moteur, à partir de 300 rpm pendant au moins cinq coups pour dissocier les hépatocytes de la structure hépatique.
Abaissez le tube de verre à chaque fois. Prévenir l’aération, qui pourrait causer la dénaturation des protéines, en gardant le pilon en dessous de la solution. Ensuite, augmenter la vitesse à 900 rpm pour homogénéiser pleinement les tissus hépatiques pendant au moins 12 coups complets.
Transférer le lysate dans des tubes étiquetés et pré-réfrigérés avec pas plus d’un millilitre de lysate chacun. Pour commencer la lyse nucléaire, centrifugeuse le foie lysate à 2000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, puis transférer le supernatant à un nouveau tube de microcentrifugeuse pré-réfrigéré sur la glace. Ajouter 1/9e du volume supernatant de 10%NP-40 dans le tube de microcentrifugeuse sur la glace et mélanger la solution en inversant doucement le tube.
Faites tourner rapidement les tubes de microcentrifugeuse à l’aide d’une mini centrifugeuse et ajoutez 1/9e du volume de l’échantillon de 10 %DOC. Mélangez en inversant doucement les tubes de microcentrifugeuse et faites tourner rapidement les tubes de microcentrifugeuse et incubez sur la glace pendant cinq minutes. Centrifugeuse le lysate nucléaire à 20 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes et transférer le supernatant dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse pré-réfrigérés sur la glace.
Pour chaque tube, sortez 1 % du volume total du supernatant comme contrôle pré-immunoprécipitation. Placez les commandes de pré-immunoprécipitation sur un rotateur à tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Prenez un soin supplémentaire à resuspendre doucement la matrice d’affinité par pipetting, puis ajoutez 200 microlitres à chaque échantillon.
Incuber les lysates à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec un mélange doux sur un rotateur à tube. Pour isoler l’ARN, tournez rapidement vers le bas les tubes contenant les lysates dans la mini centrifugeuse et recueillez les perles en plaçant sur la grille magnétique pendant au moins une minute. Recueillir le supernatant dans d’autres tubes de microcentrifugeuse.
Ajouter un millilitre de tampon frais à haute teneur en sel à chaque tube, suivi d’un tuyautage doux au moins cinq fois sans introduire de bulles. Recueillir les perles sur le support magnétique sur la glace pendant plus d’une minute et enlever le surnatant. Répétez les étapes de lavage encore quatre fois.
Ensuite, retirez les tubes de microcentrifugeuse du support magnétique et placez-les à température ambiante pendant cinq minutes pour vous réchauffer. Resuspendez les perles dans 100 microlitres de tampon de lyse avec 0,7 microlitres de bêta-mercaptoéthanol pour libérer l’ARN lié de la matrice d’affinité. Vortex les tubes pendant au moins cinq secondes à la vitesse la plus élevée et tourner rapidement vers le bas.
Ensuite, incuber les tubes à température ambiante pendant 10 minutes. Placez les tubes sur le support magnétique pendant au moins une minute, puis recueillez le supernatant et procédez immédiatement au nettoyage de l’ARN selon le protocole de purification de l’ARN dans le kit. Pour atteindre la qualité maximale de l’ARN isolé, effectuez toutes les étapes facultatives, y compris la digestion du DNase et toutes les étapes d’élitution de l’ARN, y compris le préchauffage recommandé du tampon d’élitution à 60 degrés Celsius.
Dans cette étude, la fusion GFP-L10A et les transgènes Fah ont été co-livrés dans un vecteur de piège plasmide contenant du transposon aux foies par injection hydrodynamique. L’enlèvement de la nitisinone induit une lésion hépatique toxique. La coloration d’immunofluorescence a confirmé la coexpression de la protéine de fusion FAH et GFP-L10A et des hépatocytes répugnants après deux semaines de repeuplement de foie.
L’échantillon quiescent a produit le rendement le plus élevé de protéine de fusion, puisque tous les hépatocytes expriment GFP-L10A après injection d’AAV8-TBG-Cre. Inversement, presque aucun ARN n’était détectable dans les contrôles de type sauvage qui n’avaient pas le transgène GFP-L10A, ce qui indique que la procédure TRAP est très spécifique et a un fond bas. Quand TRAP a été employé sur le tissu de foie subissant le repeuplement avec les hépatocytes transduced de GFP-L10A, l’ARN de haute qualité abondant a été obtenu.
En revanche, aucune trace d’ARN n’a été détectée via Bioanalyzer pour l’échantillon de contrôle négatif. L’expression de Gsta1 a été induite par plus de dix fois dans les hépatocytes répugnants par rapport aux hépatocytes quiescents, alors qu’aucune valeur de cycle de seuil n’a été détectée avec l’ARN TRAP-isolé de la souris sauvage de type dû au manque d’ARN d’entrée. Lors de l’homogénéisation du tissu, assurez-vous de déplacer le pilon lentement pour empêcher l’aération.
Après l’isolement de l’ARN, le séquençage à haut débit ou qPCR peut être effectué pour analyser l’expression des gènes. Avec TRAP-seq, nous avons maintenant une méthode pour isoler spécifiquement l’ARN des hépatocytes répugnants et analyser le changement dans l’expression des gènes pendant le repeuplement du foie. Cela nous permet d’identifier les gènes qui sont modifiés au cours de ce processus et les cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement des lésions hépatiques.
Le cycloheximide et la TNT, présents dans plusieurs zones tampons, sont tous deux toxiques. Les déchets doivent être collectés et jetés conformément aux lignes directrices institutionnelles.
