В клинической практике принято считать, что каждый яйцеклетка, отображающая полярное тело, готова к оплодотворению. Изображение жизни созревания яйцеклеток человека показывает, что полярное тело становится видимым задолго до того, как собирается биполярная метафаза II шпиндель, создавая риск несвоевременной инъекции спермы. Поляризованная световая микроскопия позволяет неинвазивную визуализацию мейотической шпинделя в яйцеклетках человека, и может быть безопасно использована в IFV для оценки зрелости яйцеклетки до интрацитоплазмической инъекции спермы.
Оптимизация сроков ИКСИ особенно важна при плохом прогнозе циклов ЭКО, при этом небольшое количество яйцеклеток доступно для оплодотворения. Эта клиническая процедура является дополнением к стандартному лечению ЭКО и должна быть предварительной формой опытного персонала в соответствии с передовой лабораторной практикой. Через 35-36 часов после инъекции хорионического гонадотропина человеком, соберите извлеченные комплексы кумуляции-ооцитов в среде обработки двуокиси углерода.
Эквилибрировать яйцеклетки в течение 10-15 минут в независимом от углекислого газа инкубаторе при 37 градусах Цельсия. Подвергайте яйцеклетки высокому раствору гиалуронидазы, разбавленному при обработке среды. Через 30 секунд используйте 200 микролитровых пипеток для механического удаления клеток кумулятора-короны.
Оцените количество и состояние развития оголовых яйцеклеток в зависимости от наличия или отсутствия ядра и первого полярного тела. Поместите стадию зародышевой везикулы, а метафазу I и метафазу II стадии ооцитов в отдельные капли среды, независимой от двуокиси углерода, покрытые минеральным маслом. Затем поместите ооциты при 37 градусах Цельсия, 5%углекислом газе и 6%кислороде с влажностью от 3 до 4 часов.
Для подготовки культивации пластин для эмбриональной культуры добавьте соответствующий объем предварительно уравновешенной среды культуры к отдельным колодцам соответствующей культуры. Обложка капель с equilibrated минеральное масло, этикетка пластины с уникальным идентификатором, и поместить его в углекислый газ-зависимых uncubator, по крайней мере 20 минут. Чтобы подготовить блюдо ICSI, добавьте 5 капель микролитров предварительно разогретой среды обработки для каждого полярного тела, отображающих яйцеклетки, и одну дополнительную каплю для мытья иглы в чистую пластиковую тарелку.
Добавьте дополнительную каплю PVP-раствора для иммобилизации спермы до интрацитоплазмической инъекции спермы и наложить капли с предварительно разогретым минеральным маслом. Убедитесь в том, чтобы обозначить блюдо. Затем поместите блюдо для инъекций спермы в инкубатор, независимый от двуокиси углерода, по крайней мере 20 минут.
В то время как пластина равномерна, добавьте 5 капель микролитров предварительно разогретой среды обработки для каждого полярного тела, отображая яйцеклетки, в блюдо культуры со стеклянным дном. Наложить все капли с предварительно разогретой минеральной нефти. Убедитесь в том, чтобы обозначить блюдо.
Затем поместите пластину в инкубатор, независимый от двуокиси углерода, по крайней мере 20 минут. В то время как пластины уравновешены, включите нагретую сцену на перевернутом микроскопе и поместить стерильную и инъекционную иглу спермы в держатели микро-инъекций. Принесите иглы в фокус, и выбрать соответствующую цель, заботясь о том, что конденсатор находится в ярком положении поля.
Вставьте зеленый фильтр помех и установите ползунок анализа жидкокристаллического анализа в рабочее положение. Установите затвор примерно до 50% и отрегулируйте круговой поляризатор, чтобы уменьшить фоновый шум. Для настройки компьютера для поляризованной световой микроскопии, запустите программное обеспечение для визуализации, а также выберите видео, видео источник и polarAIDE в меню видео.
Затем переключитесь на живое видео, заехав на страницу Видео, и выберите значок для активации шпинделя и анализа zona. Чтобы определить зрелость каждого яйцеклетки, перенесите все яйцеклетки в отдельные капли на приготовленное блюдо из стекла и поместите блюдо, обнаруженное под подготовленным перевернутым микроскопом. Принесите первый яйцеклетки в фокусе, и наблюдать обнаруженных яйцеклеток birefringence изображение, как это компьютер обрабатывается и отображается в режиме реального времени на экране компьютера.
Используйте удерживаее и иглы впрыски спермы для того чтобы повернуть oocyte поэтому полярное тело находится в положении 12 часов и сфокусировать на полярном теле. Если шпиндель birefringence не ясно видно на первый взгляд в непосредственной близости от ПБ, слегка коснуться zona pellucida и осторожно повернуть яйцеклетки вокруг каждой оси, чтобы обеспечить выравнивание поляризованного света с массивом шпинделя волокон. После выявления всех шпиндель положительных яйцеклеток, передача ооцитов в отдельные капли в рамках подготовленного блюда ИКСИ, и подвергать яйцеклетки интрацитоплазмической инъекции спермы в соответствии со стандартными протоколами.
Если яйцеклетки не проявляют обнаруживаемого метафазы II шпинделя сигнала, поместите поляризованный свет микроскоп блюдо в углекислый газ независимого инкубатора в течение 2 до 3 часов. Перед повторной предварительной формы поляризованной световой микроскопии обследования, как попродемонстрировано, после инъекции, передача яйцеклеток в подготовленные пластины выращивания эмбриона для их культуры до стадии бластоцист не будет достигнута. Позаботьтесь о том, чтобы все микроманипуляции яйцеклеток человека осуществляется в среде контроля, на 37 градусов, в оптимальной культуре среднего рН.
Спиндл визуализации позволяет дискриминации полностью зрелых яйцеклеток, арестованных в метафазы II этапе, от тех, кто переживает важный переход созревания. При задержке в развитии ооцитов, экструдирующих полярные тела в пробирке, отсутствие метафазы II шпиндельного сигнала не обязательно отражает клеточное нарушение, но может свидетельствовать о прогрессировании яйцеклетки от метафазы I до стадии метафазы II. Наличие мейотического шпинделя является положительным маркером компетенции развития яйцеклеток.
Отсрочка ИКСИ дает отсроченно от развития яйцеклетки дополнительное время для завершения процесса созревания и сборки шпинделя метафазы II перед их инъекцией. Используя этот подход, даже незрелые яйцеклетки, которые обычно отбрасываются могут быть клинически использованы, и привести к успешной беременности.
