Этот анализ позволяет студенту искать конкретные молекулы во многих процессах развития, таких как дифференцировка клеток и морфогенез, путем имплантации шариков в отдельные области эмбриона. Этот протокол может быть применен к любым экспериментальным моделям животных, клеточной культуре, органотипической модели, включая органоиды. Кроме того, это полезный образовательный инструмент для обучения базовой биологии развития студентов.
Продемонстрировать процедуру будет Александра Гонсалес-Гонсалес, студентка бакалавриата из лаборатории. Для начала высиживают оплодотворенные белые куриные яйца Leghorn вертикально заостренной стороной вниз в увлажненном инкубаторе при 38 градусах Цельсия и относительной влажности 70%. Как только они достигнут 28-й стадии, по словам Гамбургера и Гамильтона, извлеките яйца из инкубатора, замените их 70% этанолом и дайте им высохнуть на воздухе.
Затем продезинфицируйте рабочую зону, микроскопы и инструменты 70% этанолом. Затем подсвечивайте яйца, чтобы идентифицировать кровеносные сосуды и найти эмбрион. Выбросьте яйца, у которых нет эмбриона.
Используя конец незубчатых щипцов, откройте окно, постукивая тупым концом яйца, и удалите участок скорлупы площадью один квадратный сантиметр. Затем переложите яйцо в картонную коробку или пластиковый держатель и поместите его под стереомикроскоп. Используя тонкие хирургические щипцы, удалите любой маленький кусочек яичной скорлупы, который может контактировать с эмбрионом, и удалите воздушную мембрану, проколов и вытащив ее.
Далее, используя тонкие хирургические щипцы, слегка порвать амниотический мешок, стараясь не повредить сосудистую систему хориоаллантоической оболочки. Стадия эмбрионов in-ovo, чтобы определить, находятся ли они в желаемой стадии. Для приготовления гепариновых шариков Аффи-геля вырежьте секцию парапленки квадратной формы, чтобы поместиться в 45-миллиметровую чашку Петри.
Поместив парапленку на дно чашки Петри, используя конец незубчатых щипцов, протолкните каждую вершину и зафиксируйте ее на дне тарелки. Затем, используя пипетку или шпатель, переложите шарики в микроцентрифужную трубку и дважды промыть их PBS, позволив им осесть и пипетировать супернатант. Затем, используя микропипетку, переложите от 40 до 50 бусин к центру парапленки, покрытой чашкой Петри.
Под микроскопом выберите 30 аффи-гелевых или гепариновых шариков диаметром 100 микрометров. Размер бусин с использованием третьего интердигита 28-стадийного эмбриона в качестве эталона. Шарик должен быть меньше, чем интердигит.
После тщательного удаления излишков ПБС, окружающих выбранные бусины, замочите их в двух-пяти микролитрах лечебного раствора. Инкубировать шарики в растворе в течение 30 минут при комнатной температуре. Во время инкубации, чтобы предотвратить высыхание бусин, пипетка несколько капель PBS или вода вокруг бусин, чтобы увлажнить местную атмосферу и покрыть блюдо парапленкой для замедления испарения.
Залить бусинами AG1X2. Используйте шпатель для переноса шариков в микроцентрифужную трубку и добавьте 50 микролитров лечебного раствора в желаемой конечной концентрации. После обертывания тюбиков фольгой для защиты их от света, высиживают бусины в течение 20 минут при медленном встряхивании.
После инкубации, используя пипетку, удаляют как можно больше лечебного раствора в пятно с 0,2% фенолом красного цвета, растворенным в воде в течение двух минут с легким перемешиванием в вихре. После окрашивания удалите краситель, затем дважды вымойте бусины в PBS, чтобы удалить остаточный краситель. Затем, используя наконечник микропипетки, переложите от 40 до 50 бусин AG1X2 к центру параформы, покрытой чашкой Петри, и замочите бусины в пяти микролитрах PBS.
Затем под микроскопом выберите около 30 бусин диаметром 100 микрометров. Погрузите выбранные бусины в экспериментальный раствор с несколькими каплями PBS или водой вокруг бусин для увлажнения местной атмосферы. Накройте блюдо парапленкой для замедления испарения.
Прежде чем манипулировать эмбрионами, расположите два стереомикроскопа рядом друг с другом на столешнице. Затем, используя незубчатые щипцы, создайте окно в оставшихся яйцах. Далее под микроскопом разрыв амниотической оболочки возле правой задней конечности тонкими хирургическими щипцами.
Используя тонкие щипцы, держите эмбрион за амниотическую мембрану, чтобы обнажить правую заднюю конечность. Затем, используя тонкую вольфрамовую иглу, сделайте отверстие, центрированное в самой дистальной части третьего интердигита задней конечности. Не выпуская эмбрион и обнаженную заднюю конечность, возьмите одну обработанную бусину из другого микроскопа, используя один из кончиков щипцов.
Щипцы должны быть открыты, чтобы одна бусина прилипла к ее кончику. Перенесите шарик в эмбрион цыпленка возле задней конечности, расположив его поверх отверстия интердигита. надавите на шарик, закрыв щипцы до тех пор, пока он не войдет в отверстие.
Затем отпустите эмбрион, запечатайте скотчем окно яичной скорлупы и верните яйца в инкубатор до тех пор, пока они не достигнут необходимой стадии. Чтобы обеспечить эффективность анализа, шарик должен быть размещен последовательно и точно в правильном месте. В этом исследовании пропитанная бусина была помещена в самую дистальную часть третьего интердигита под апикальным эктодермальным гребнем.
Эмбрионы могут быть окрашены океанским синим и ализариновым красным, чтобы свидетельствовать о формировании скелетных элементов и оценивать влияние на дифференцировку клеток. Этот анализ также хорошо подходит для оценки гибели клеток с нейтральной красной и генной регуляцией, покупая гибридизацию C2. Основным преимуществом этого экспериментального инструмента является контроль времени и местоположения замоченных бусин.
Сочетание позиционирования ядра с точным временем развития предоставляет огромные возможности для изучения процессов дифференцировки клеток.
