Dans la pratique clinique, il est d’usage de supposer que chaque ovocyte affichant un corps polaire est prêt pour la fécondation. L’imagerie de vie de la maturation des ovocytes humains révèle qu’un corps polaire devient visible bien avant l’assemblage du fuseau bipolaire metaphase II, créant ainsi le risque d’une injection prématurée de sperme. La microscopie lumineuse polarisée permet une visualisation non invasive du fuseau méiotique chez les ovocytes humains, et peut être utilisée en toute sécurité en IFV pour évaluer la maturité des ovules avant l’injection intracytoplasmique de sperme.
L’optimisation du moment de l’ICSI est particulièrement importante dans le mauvais pronostic des cycles de FIV, avec un faible nombre d’ovocytes disponibles pour la fécondation. Cette procédure clinique est une technique supplémentaire au traitement standard de FIV, et devrait être préformée par le personnel expérimenté, en conformité avec les bonnes pratiques de laboratoire. 35 à 36 heures après l’injection humaine de gonadotropine chorionique, recueillir les complexes cumulus-ovocytes récupérés dans le milieu de manipulation indépendant du dioxyde de carbone.
Equilibrer les ovocytes pendant 10 à 15 minutes dans un incubateur indépendant du dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Exposer les ovocytes à une solution hyaluronidase élevée, diluée dans la manipulation moyenne. Après 30 secondes, utilisez une pipette de 200 microlitres pour enlever mécaniquement les cellules cumulus-corona.
Évaluer le nombre et l’état de développement des ovocytes dénudés en fonction de la présence ou de l’absence du noyau et du premier corps polaire. Placez le stade germinal de vésicule, et les ovocytes de stade de metaphase I et de metaphase II dans les gouttelettes individuelles du milieu de culture carbone-indépendant, couvertes d’huile minérale. Ensuite, placez les ovocytes à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 6% d’oxygène avec de l’humidité pendant 3 à 4 heures.
Pour préparer les plaques de culture pour la culture embryonnaire, ajoutez le volume approprié de culture prééquilibrée moyenne aux puits individuels d’une plaque de culture de taille appropriée. Couvrir les gouttelettes d’huile minérale équilibrée, étiqueter la plaque d’un identificateur unique et la placer dans un uncubateur dépendant du dioxyde de carbone pendant au moins 20 minutes. Pour préparer le plat ICSI, ajouter 5 gouttelettes de microlitres de milieu de manipulation préchauffé pour chaque ovocyte polar affichant le corps, et une gouttelette supplémentaire pour le lavage des aiguilles à un plat en plastique propre.
Ajoutez une gouttelette supplémentaire de solution PVP pour l’immobilisation du sperme avant l’injection intracytoplasmique de sperme, et superposez les gouttelettes avec de l’huile minérale préchauffée. Assurez-vous d’étiqueter le plat. Ensuite, placez le plat d’injection de sperme dans un incubateur indépendant du dioxyde de carbone pendant au moins 20 minutes.
Pendant que la plaque est équilibrée, ajouter 5 gouttelettes de microlitre de milieu de manipulation préchauffé pour chaque ovocyte polaire affichant le corps à un plat de culture à fond de verre. Superposer toutes les gouttelettes d’huile minérale préchauffée. Assurez-vous d’étiqueter le plat.
Ensuite, placez la plaque dans un incubateur indépendant du dioxyde de carbone pendant au moins 20 minutes. Pendant que les plaques sont équilibrantes, allumez la scène chauffée sur le microscope inversé et adaptez l’aiguille stérile de fixation et d’injection de sperme dans les supports de micro-injection. Mettre les aiguilles au point, et sélectionnez l’objectif approprié, en prenant soin que le condenseur est dans la position de champ lumineux.
Insérez le filtre d’interférence vert et réglez le curseur d’analyse de cristaux liquides en position de travail. Réglez l’obturateur à environ 50% et ajustez le polariseur circulaire pour diminuer le bruit de fond. Pour configurer l’ordinateur pour l’examen de microscopie lumineuse polarisée, lancez le logiciel d’imagerie et sélectionnez Video, Video Source et polarAIDE dans le menu Vidéo.
Ensuite, passez à la vidéo en direct en allant à la page vidéo et sélectionnez l’icône pour activer l’analyse fuseau et zona. Pour déterminer la maturité de chaque ovocyte, transférez tous les ovocytes dans des gouttelettes individuelles sur le plat préparé à fond de verre et placez le plat à découvert sous le microscope inversé préparé. Mettre le premier ovocyte au point, et d’observer l’image de birefringence ovocyte détecté, car il est traité par ordinateur et affiché en temps réel sur l’écran de l’ordinateur.
Utilisez les aiguilles de détention et d’injection de sperme pour tourner l’ovocyte de sorte que le corps polaire est dans la position de 12 heures et se concentrer sur le corps polaire. Si la birefringence du fuseau n’est pas clairement visible à première vue à proximité de PB, touchez légèrement la zona pellucida et tournez doucement l’ovocyte autour de chaque axe pour assurer l’alignement de la lumière polarisée avec les fibres de fuseau de tableau. Après avoir identifié tous les ovocytes positifs de fuseau, transférez les ovocytes dans les gouttelettes individuelles dans le plat préparé d’ICSI, et soumettez les ovocytes à l’injection intracytoplasmique de sperme selon les protocoles standard.
Si les ovocytes ne présentent aucun signal de fuseau méthaphase II détectable, placez le plat polarisé au microscope léger dans l’incubateur indépendant du dioxyde de carbone pendant 2 à 3 heures. Avant de réformer l’examen de microscopie lumineuse polarisée tel que démontré, après l’injection, transférez les ovocytes dans les plaques de culture d’embryons préparées pour leur culture jusqu’à ce que le stade blastocyste soit atteint. Veillez à ce que toute la micromanipulation de l’ovocyte humain soit effectuée dans un environnement de contrôle, à 37 degrés, dans un pH moyen de culture optimal.
L’imagerie par fuseau permet la discrimination des ovocytes entièrement matures arrêtés au stade de la métaphyse II, de ceux qui subissent une importante transition de maturation. Dans les ovocytes retardés sur le plan du développement qui extruent les corps polaires in vitro, l’absence du signal du fuseau métaphe II ne reflète pas nécessairement une perturbation cellulaire, mais pourrait indiquer la progression de l’ovocyte de la métaphyse I au stade de la métaphoase II. La présence du fuseau méiotique est un marqueur positif de la compétence développementale des oeufs.
Le report de l’ICSI fournit aux ovocytes retardés sur le plan du développement plus de temps pour terminer le processus de maturation et pour assembler le fuseau méthaphase II avant leur injection. En utilisant cette approche, même les ovocytes immatures qui sont couramment jetés peuvent être utilisés cliniquement, et donner lieu à des grossesses réussies.
