Мы разработали определенный, воспроизводимый и давний протокол для секвенирования малых РНК и для анализа нормализованных считывания с использованием инструментов биоинформатики с открытым исходным кодом. Основными преимуществами нашей стратегии являются то, что она точно собирает микроРНК с помощью гель-очистки и что анализ биоинформатики может быть применен независимо от того, как собираются микроРНК. Высокая пропускная способность секвенирования микроРНК может выявить понимание механизмов заболевания, обработки микроРНК и точной количественной оценки подходов генной терапии, которые обеспечивают небольшие РНК.
Убедитесь в том, чтобы работать в свободной среде RNase и держать все продукты РНК на льду на протяжении всей процедуры. Визуализация шагов резки геля поможет зрителям определить правильный размер продуктов, необходимых для приложений ниже по течению. Для трех основных перевязок адаптера, объединить 11 микролитров РНК с 1,5 микролитров АТФ бесплатно 10X T4RNA лигазы реакции буфера, один микролитер полиэтиленгликоль, и 0,5 микролитров из трех основных связующим звеном.
Нагрейте образцы при температуре 95 градусов по Цельсию на термоциклере в течение 30-40 секунд, а затем охлаждение на льду в течение одной минуты. Добавьте один микролитер T4RNA ligase два и инкубировать реакцию при комнатной температуре в течение двух часов. В то время как образцы инкубации, залить 15%полиацириламид гель между 0,8 миллиметра разделенных стеклянных пластин в пластиковый литые и вставить гребень.
Когда гель затвердеет, добавьте 0,5 5X TBE в бак и пипетку энергично мыть колодцы остаточной мочевины. После предварительного запуска полиакриламинидного геля в течение 25 минут при 375 вольт, загрузите образцы, оставляя по крайней мере одну полосу между каждым образцом. Загрузите 20 микролитров по крайней мере двух наборов маркеров в асимметричном рисунке, чтобы отслеживать ориентацию геля и запустить гель на постоянной 375 вольт.
После 15 минут, увеличить до постоянного 425 вольт для остальной части запуска и запустить гель в течение примерно двух часов. В конце пробега используйте сепаратор пластины, чтобы удалить гель из стеклянных пластин и поместить гель на пластиковый протектор страницы. Разбавить пять микролитров бромистого этидия в 500 микролитров дистиллированной воды и добавить краситель на маркер полосы чуть выше верхней светло-голубой маркер.
Далее, используйте чистый лезвие бритвы, чтобы сократить гели от верхнего до нижнего маркера в каждой полосе под ультрафиолетовым светом и передачи частей на четыре на четыре сантиметра квадрат лабораторной герметизации пленки. Вырезать гель с около трех разрезов горизонтально и два разреза вертикально производить 12 небольших квадратов. Добавьте 400 микролитров 0,3 молярного хлорида натрия в уплотнительную пленку и навейте кусочки геля в 1,5 миллилитровые силиконовые трубки.
Агитировать образцы на nutator при четырех градусах по Цельсию в одночасье. На следующее утро перенесите 400 микролитров каждого супернатанта в новые трубки. Добавьте один миллилитр 100% этанола и один микролитр 15 миллиграммов на миллилитр гликогена на одну трубку.
Затем храните трубки при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение одного часа. Для пяти основных перевязки связующим звеном, сначала спина вниз оттаяли образцы и повторно гранулы в воде. Далее добавьте 0,5 микролитра из 100 микромолейных пяти простого связующим звена, один микролитр буфера T4RNA ligase, один микролитр 10 миллимолярный АТФ и один микролитр полиэтиленгликоль к каждому образцу.
Нагрейте реакции при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 30 секунд, прежде чем поместить их на лед. Затем добавьте один микролитер T4RNA лигазы по одному к каждой трубке и инкубировать реакции при комнатной температуре в течение двух часов. Для обратной транскрипции, собирать образцы центрифугации и повторного перерасхода воздуха сушеные гранулы в 8,25 микролитров нуклеазы свободной воды.
Добавьте 0,5 микролитров 100 микромоляных реверсивных транскриптазных грунтовок и пять микролитров смеси реакции обратной транскриптазы 2X из дополнительного комплекта синтеза ДНК. После трех минут при 42 градусах по Цельсию добавьте 1,5 микролитров фермента обратной транскриптазы 10X в каждый образец в течение 30-минутной инкубации при 42 градусах Цельсия в термоциклере. После нейтрализации подготовить ПЦР-реакцию с 29,5 микролитров воды, пять микролитров 10X так буфера, один микролитр нуклеозидного трифосфата, два микролитера 25 микромолейных вперед грунтовки, два микролитера 25 микромоляных обратный грунтовка, 0,5 микролитров taq полимеразы, и 10 микролитров обратного транскритера дополнительной ДНК.
Затем запустите две реакции ПЦР. Для очистки геля агарозы, подготовить 4%agarose гель с низким таянием агарозы и загрузить 40 микролитров или более продукта ПЦР на гель с загрузкой красителя и 100 базовой пары и 25 базовых маркеров размера пары. После запуска геля, вырезать полосу выше 125 базовой пары полосы и использовать гель извлечения комплект в соответствии с инструкциями производителя.
Встряхните, чтобы растворить гелевую полосу в буфере при комнатной температуре, прежде чем использовать соответствующее оборудование для количественной оценки библиотеки окончательной последовательности. Затем используйте соответствующие инструменты биоинформатики с открытым исходным кодом для анализа данных последовательности. В этой репрезентативной реакции ПЦР на гель с низким содержанием расплава агароза можно наблюдать приобретение правильного клонированного продукта по сравнению с полученным связующим продуктом и ненасыщенными по сравнению с насыщенными образцами.
После выравнивания с человеческой микроРНК шпильки, сильное соответствие между микроРНК читать рассчитывает в каждой репликации можно наблюдать. В общей сложности было обнаружено 306 видов микроРНК, при этом наибольшее количество считых считых карт было зарегистрировано на микроРНК 122. Важно помнить, чтобы сократить гели при соответствующем размере, чтобы обеспечить точное восстановление микроРНК.
После секвенирования микроРНК пользователи могут применить биоинформатический анализ для характеристики распределения микроРНК в своих тканях, представляющих интерес. Этот метод был использован для определения того, как микроРНК обрабатываются и какие наборы микроРНК изменяются при некоторых видах рака. Будьте уверены, проявлять осторожность при обработке бромистого этидия и при взгляде на гели под ультрафиолетовым светом.
