Учитывая широкий спектр коротких пептидных последовательностей, этот метод может быть распространен на многие другие наночастицы конструкций. Пептидная модификация может сделать систему пригодной для диагностических целей. Инкапсуляция противоопухолевой платины препаратам с биоразлагаемым стабилизирующим средством низкой токсичности является весьма актуальной для фармацевтического применения.
Предварительные исследования in-vivo с раком яичников являются многообещающими и будут дополнительно исследованы. Для начала приостанавливаем 50 миллиграммов цисплатина в четырех миллилитров ультра-чистой воды при 60 градусах Цельсия. Добавьте раствор нитрата серебра в раствор цисплатина и перемешайте смесь при 300-400 об/мин в течение двух часов при 60 градусах Цельсия в темноте.
После этого используйте 10% по весу соляной кислоты, чтобы подтвердить, что в растворе нет свободных ионов серебра. Если нет дополнительных форм хлорида серебра при добавлении соляной кислоты, центрифуга смеси при 3, 220 раз тяжести в течение 10 минут. Декант супернатант и фильтровать его через 0,2 микрометровый фильтр шприца.
Затем проверьте фильтрат на платину, применяя две-три капли до 10 двух кристаллов хлорида. Платина присутствует, если подвеска становится темно-коричневой или оранжевой. Далее добавьте 13,3 миллиграмма гидроксида натрия в один миллилитр воды в 94,2 миллиграммовую суспензию олеиновой кислоты в трех миллилитров воды при 60 градусах Цельсия.
Перемешать смесь в течение двух часов при 60 градусах по Цельсию. Затем выключите огонь и продолжайте помешивать при комнатной температуре в течение 16-24 часов, чтобы получить сырой продукт в качестве жирного, желто-коричневого осадка. Центрифуга реакционной смеси при 3, 220 раз тяжести в течение 10 минут, и удалить супернатант.
Высушите продукты на роторном испарительном средстве при 25 градусах цельсия. Приостановить сырой продукт в пять миллилитров ацетонитрила путем вихря и восстановления продукта центрифугации. Повторите этот процесс стирки по крайней мере еще два раза, чтобы получить чистый, олеиновой кислоты платины II конъюгации, как бледно-желтый твердый.
Во-первых, замочить 5,7 граммов Fmoc защищены L-фенилаланин функционализированной смолы Ван в 25 миллилитров диметилформамида в течение одного часа. Затем, замочить смолы в 15 миллилитров 20%пиперитина в DMF в течение пяти минут при встряхивании при 80 об /мин для де-защиты амина. Слейте смолу и повторите дезащиту в течение 20 минут.
Вымойте смолу с DMF и изопропиловым спиртом после этого. После того, как де-защита была подтверждена, добавить Fmoc защищены L-тирозин TBTU и DIPEA и агитировать смесь в течение 16 до 24 часов для выполнения соединения. Вымойте смолу dMF и изопропиловым спиртом.
Выполните тест Kaiser и продолжайте с дезащитой и мытьем, как описано ранее. Пара и де-защиты Fmoc защищены лизин таким же образом. Вымойте смолу с DMF, IPA, метанол, дихлорметан, и диэтил эфир потом.
Отложите один грамм KYF-подшипниковой смолы для модификации FITC. Замочите оставшуюся смолу в 95%trifluoroacetic кислоты. 2.5%triisopropylsilane и 2.5%water на 3 часа для того чтобы cleave трипептид от смолы.
Осадок сырой пептид с диэтил эфир охлаждается до 20 градусов по Цельсию. Вымойте осадок три раза центрифугации в 30 до 40 миллилитров порций холодного диэтил эфира и высушить его под вакуумом. Затем смешайте оставшийся грамм смолы KYF со 120,1 миллиграммами 6-ацетохексановой кислоты в 30 миллилитров DMF с TBTU и DIPEA.
Агитировать смесь в течение 16 до 24 часов при комнатной температуре, чтобы получить азид модифицированный трипептид. Затем объедините 253 миллиграмма этой смолы с 3,78 миллиграммами твердой меди (I)йодида 71,9 миллиграмма пропаргильного флориана и 2,24 миллиграмма DIPEA. Пусть смесь реагировать во время встряхивания в течение 24 часов.
Затем тщательно промыть FITC модифицированной KYF подшипников смолы. Отлепить FITC модифицированный KYF из смолы и очистить его так же, как неизмененные трипептида. Чтобы начать подготовку наномульсии, растворите 10 миллиграммов олеиновой кислоты платины II конъюгировать в 1,5 миллилитров АПИ.
Нарисуйте этот раствор в 5 миллилитров шприц, прикрепите 20 калибровочных игл и смонтировать шприц на шприц насос над областью реакции. Установите шприц-насос до 0,1 миллилитров в минуту. Для наномульсии с модифицированным КИФ FITC растворите один миллиграмм модифицированного KYF FITC и один миллиграмм неизмененных KYF в 20 миллилитров воды.
Для наномульсии с неизмененным KYF, вместо растворить два миллиграмма KYF в 20 миллилитров воды. Нагрейте модифицированный или неизмененные решения KYF fitC до 37 градусов по Цельсию. Убедитесь, что раствор KYF перемешивается при 400 об/мин, и что шприц выровнен с раствором.
Затем, начать шприц насос, чтобы начать добавлять олеиновой кислоты платины два конъюгированных капли мудрым. После добавления конъюгата уменьшите скорость перемешивания до 150 об/мин и дайте раствору остыть до комнатной температуры. Продолжайте перемешивать его в течение 16 до 24 часов.
Затем сосредоточьте наномультион в центробежном фильтре 10 000 Далтонов. Вымойте наномульсию в центробежном блоке фильтра три раза с четырьмя миллилитровыми порциями ультрапурной воды. А затем хранить его в качестве aqueous решение при четырех градусах по Цельсию.
Конечный продукт является опалесцентным для наночастиц KYF и флуоресцентным для модифицированных наночастиц FITC. Капли в наномульсии, приготовленные с неизмененным KYF, были сферическими, хорошо рассеянными и относительно однородными по размеру. На основе изображений электронной микроскопии передачи, ядра были около 107 нанометров в диаметре.
Модифицированная FITC наномульсия, которая появляется здесь зеленым цветом, может проникать в клетки различных линий раковых клеток яичников. В то время как гидродинамический диаметр обеих составов увеличивался в течение четырех месяцев хранения в воде, общие размеры были сохранены. Кроме того, после дня инкубации в 20%-ной сыворотке крупного рогатого скота не наблюдалось опсонизации эмульсии.
Выпуск платины из эмульсии был самым медленным при рН 7.4, и только 20,8% платины было выпущено через четыре часа. Платиновый релиз ускорился по мере снижения рН. Платиносодержащие KYF покрытием наноэмульсии снизили жизнеспособность этих линий раковых клеток яичников в гораздо большей степени, чем было достигнуто карбоплатин, клинически соответствующий аналог.
Наномульсия также показала сопоставимое или большее снижение жизнеспособности, чем цисплатин в пяти из шести клеточных линий. Наноэмулсия с покрытием KYF постоянно индуцирована сопоставимым или большим снижением жизнеспособности, чем только спрягать платину олеиновой кислоты II. Это простой, эффективный метод инкапсуляции гидрофобных терапевтических средств в трипептид базы наночастиц эшафот.
Короткие пептиды биоразлагаемы и имеют низкую токсичность, что имеет важное значение для медицины и биотехнологии. Выполните эту процедуру под капотом дыма, чтобы избежать воздействия органических растворителей. Платиновая олеиновая кислота и платиновые наноэмулции KYF имеют противоопухолевые свойства и поэтому должны обрабатываться с особой осторожностью.
Этот метод прост с точки зрения низкой активности филабилятора и оборудования, однако он опирается на правильное применение стратегии синтеза и лежащих в основе химических концепций. Наш метод может быть расширен, чтобы доставить другие небольшие молекулы наркотиков. Ядро наночастиц состоит из олеиновой кислоты и поэтому подходит для инкапсуляции гидрофобных агентов.
