Будет продемонстрировано приготовление липосомальных нанокапсул с помощью экструзионные методы будут выполняться шаг за шагом в захвате зарина 48 килодальтонов шарового в гидрофильном белке, очищенном от коллаказии эскуленты. Все процедуры для характеристики нанокапсул включают сканирование электронной микроскопии и динамическое рассеяние света будет также следовать. Процедуры капсулирования могут столкнуться с некоторыми проблемами от выбора липидов до достижения высокой инкапсуляции эффективности, сохраняя биоактивность поглощенных молекул.
Протокол, который будет описан, может преодолеть некоторые из этих трудностей. Взвешивание липосомных компонентов с использованием аналитического баланса. Растворите липидные компоненты в хлороформе с помощью объемной колбы, которая помещается в роторный испаритель, чтобы избежать потери материала.
Перемешать смесь при 150 об/мин в течение 15 минут. Удалите хлороформ с помощью роторного испарителя. Отрегулируйте громкость колбы рот в стандартное положение для лучшей эффективности, в то время как в контакте с водой из нагревательной ванны.
Установите параметры в соответствии с описанным протоколом. Примерно через 25 минут снимите колбу и соответствующим образом отбросьте испаряемый растворитель. Тонкая и непрозрачная пленка образуется и может быть легко визуализирована.
Гидрат липидной пленки в растворе сульфата аммония, содержащего зарин на один миллиграмм на миллилитр. Перемешать смесь в течение 40 минут и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию. Затем, sonicate подвески в течение одной минуты при температуре 25 градусов по Цельсию, комнатной температуры.
Чтобы уменьшить размер пузырьков и избежать агрегации, поместите поликарбонатную мембрану между двумя предварительно влажными опорами фильтра и поместите ее в держатель. Вставьте один пустой шприц в устройство, заполните другой одним миллилитром липосомальной подвески и вставьте его на противоположной стороне. Выполните экструзию цикла 12 через мембрану поликарбоната 2 микрометра.
Медленно отталкивай образец от одного шприца к другому. В конце липосомальная подвеска должна стать ясной в процессе экскурсии, в результате уменьшения размера. Около 2 миллилитров образца могут быть потеряны во время этого шага.
Разделить липосомы ультрацентрифугации. Во-первых, взвесить образец в титановую трубку и сбалансировать трубки. Проверьте минимальный объем, который будет заполнен, и при необходимости, отрегулируйте объем сульфатом аммония.
Fit титановых труб в ведро качели. Откройте дверь центрифуги и поместите ротор внутрь. Закройте дверь центрифуги, нажмите вакуум, и ждать, пока вакуум достигает от 200 до менее чем 20 микрон.
Отрегулируйте параметры на ультрацентрифуговом дисплее. Пресса вспомнить, проверить условия, и начать работать. Через 90 минут отпустите вакуум, нажав кнопку вакуума и откройте дверь центрифуги.
Удалите ротор изнутри. Поддерживайте образец ультрацентрифуга на льду, а затем отделяйте супернатант от гранул, переворачивая трубку вверх дном, в одноразовую центрифугу 59 миль, чтобы отделить супернатант от гранул. Храните супернатант, содержащий неуязвимый белок при четырех градусах Цельсия.
Это будет использовано для определения эффективности инкапсуляции. Гранулы представлены как полупрозрачное желе. Приостановить гранулы и тепла HEPES буферный солевой раствор.
Пожалуйста, проверьте протокол для получения дополнительной информации. Определите эффективность инкапсуляции по протоколу Петерсона, чтобы избежать липидного вмешательства в квантификацию белка. Образцы должны быть проанализированы в трипликат.
В микрофуге трубки, разбавить lipsomal supernatant или BSA на один миллиграмм на миллилитр с водой до конечного объема одного миллилитра. Добавить DOC и инкубировать в течение 10 минут. Добавьте 1 миллилитр 72%TCA и хорошо перемешайте.
Центрифуга при температуре 3 000 г в течение 15 минут при комнатной температуре. Тщательно отбросьте супернатант, предотвратив трубку вниз, положив ее на абсорбянтную бумагу и дать ей высохнуть. Приостановить гранулы в один миллилитр воды.
Тщательно смешайте, чтобы убедиться, что гранулы растворяются. Затем перенесите образец в пробирки. Добавьте один миллилитр реагента А, перемешайте и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
Добавьте 5 миллилитров реагента B, перемешайте и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Определите абсорбцию на 750 нанометров и рассчитайте эффективность инкапсуляции. Средний размер и распределение размеров определяются динамическим рассеянием света.
Перенесите липосомальные нановезы в одноразовый размер cuvette. Fit cuvette внутри оборудования. Установите параметры оборудования.
Для определения стабильности регулярно храните липосомы при четырех градусах Цельсия и регулярно проверяйте распределение размеров и размеров. Липосомная характеристика путем сканирования электронного микроскопа выполняется в соответствии с Мурта и Ramasamy в тройной. Зафиксйте стеклянную крышку скользит в нижней части чашки Петри с лентой.
Пальто крышка скользит с Поли-L-лизин. Поместите влажную фильтровальную бумагу в чашку Петри для поддержания влажности и инкубации в течение одного часа. Промыть дистиллированной водой.
Добавьте каплю образца и дайте ему высохнуть в течение одного часа, при комнатной температуре. Чтобы исправить образцы, накройте их глутаралдегидом, приготовленным в фосфатных буферах. Поместите мокрые фильтруемые бумаги в чашку Петри.
Важно запечатать чашку Петри. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 48 часов. Промыть крышку скользит три раза в течение пяти минут каждый, с тем же фосфатным буфером.
Обезвоживаемые образцы следующим образом путем мытья в решении концентрации этанола от 35% до абсолютного этанола. Химически высушите образцы с hexamethyldisilazane в течение 10 минут. Hexamethyldisilazane должны быть тщательно манипулировать внутри дыма капот.
Образцы должны быть позволены высохнуть всю ночь внутри desiccator или внутри капота дыма при комнатной температуре. Намонтировать высушенные образцы на заглушке, с углеродной конепроводяющей клейкой лентой. Распылите заглушки золотом.
Запись SEM изображения с сканирующего электронного микроскопа, SEM, в режиме низкого вакуума и низкого напряжения, 20 киловольт. Рисунок один описывает нано липосомы подготовки. Фосфолипиды, допинг, колышек и химии, основные липосомные компоненты, были впервые растворены в хлороформе для получения липидной пленки.
Липидная пленка была затем регидратирована в солевой буфер, содержащий гидрофильные белки, зарин, чтобы быть захват, и инкубация должна быть предварительной формы в одночасье. Затем, sonication и экструзии применяются для создания небольших unilamellar пузырьков. Ультрацентрифугация шага отделяет липосомный препарат от свободных липидов, и unencapsulated белка.
В то время как супернатант используется для определения эффективности захвата. Нанолипосомы, произведенные по вышеупомянутой методологии, демонстрируют распределение размеров от 51 до 396 нанометров и средний размер 155 нанометров. Препарат однороден, так как индекс полидисперсности составляет 168.
Высокая эффективность захвата 83% достигнута, если липосомы экструдированы через мембрану размером в 2 микрометра. Морфологические нанолипосомные характеристики оценивались путем сканирования электронной микроскопии. Липосомы должны, наконец, рассматриваться так же, как живые клетки, чтобы получить лучшее качество изображения.
Процедуры фиксации и сушки важны для обеспечения визуализации небольших нетронутых пузырьков, которые поддерживают более 20 киловольт в вакуумных условиях. Цифры 2A и 2B отображают круглые липосомальные пузырьки в диапазоне 121 нанометров, анализируемые при 20 киловольтах. В то время как цифры 2C и 2D отображают недостаточно подготовленные образцы.
Плохо взятые образцы допускаются только для наблюдения за более крупными и или поврежденными пузырьками, которые не могут противостоять вакууму и или условиям напряжения. Описанный здесь протокол позволил изготовить воспроизводимые пузырьки, отображающие круглую форму, небольшую поверхность и средний размер около 150 нанометров. Метод может быть использован для захвата сложных и крупных молекул, как тетрамерный белок, экспонирование гидрофильных корректора.
Недостаточная самозахвтрака выше 80%, а уровень утечки очень низок, уступая 1,5%, когда нанокапсулы хранятся при четырех градусах Цельсия. Мы надеемся, что это видео поможет вам в инкапсуляции больших молекул, таких как тери.
