Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взрывной вредной черепно-мозговой травмы и может быть использован для проверки нейропротекторных препаратов перед использованием более сложных моделей Vivo. Основным преимуществом этого метода является то, что он использует лабораторный инструмент, чтобы подвергать в ткани мозга массы витро ударной волны с помощью простого и высокой пропускной способности протокола, который позволяет создать воспроизводимую травму. Во-первых, вставьте стерильные кольца из нержавеющей стали на заказ в колодцы из шести колодцев.
Затем добавьте предварительно разогретую без сыворотки экспериментальную среду с йодидом пропидия в скважины, чтобы уровень среды не достиг выше выемки кольца. Перенесите пластину в инкубатор на один час, чтобы убедиться, что среда находится на 37 градусов по Цельсию, прежде чем ткани культуры вставки передаются. Через час, передача культуры ткани вставки с органотипическими ломтиками от их роста блюда на кольца в шесть хорошо пластины.
Сделать точку на вставке обода в положении трех часов с пером постоянного маркера, чтобы облегчить возвращение вставки в исходное положение, а затем этикетки каждого шесть хорошо пластины с уникальным именем и датой и сделать карту колодцев каждой пластины, называя каждый хорошо с буквой и каждый ломтик в колодец с номером, так что каждый ломтик имеет уникальный идентификатор. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы обеспечить ломтики на 37 градусов по Цельсию непосредственно перед визуализацией. Через час после перехода в экспериментальную среду, оценить здоровье ломтика быстро визуализации каждого ломтика индивидуально и последовательно при низкой мощности.
Используйте флуоресцентный микроскоп, оснащенный соответствующим фильтром возбуждения и выбросов идеально в темной комнате или комнате с тусклым светом. Держите крышку на пластине при визуализации. Некоторые конденсата может создать на внутренней стороне крышки.
Если это произойдет, кратко используйте фен на низкой настройке на внешней стороне крышки. Убедитесь, что условия изображения идентичны в разные дни и между экспериментами. На базовом уровне, здоровые ломтики показывают очень мало флуоресцентного окрашивания.
Фрагменты, на которых выставлены участки плотного красного окрашивания, указывают на скомпрометированную жизнеспособность и должны быть исключены из дальнейшего анализа. Для сравнения, флуоресценция от взрыва ранен ломтик на 72 часов показано здесь. Сразу же после визуализации удалите одну культуру тканей из шести пластин и тщательно перенесите вставку в стерильный полиэтиленовый пакет, содержащий 20 миллилитров предварительно разогретой экспериментальной среды с 95%кислородом и 5%углекислым газом.
Аккуратно удалите пузырьки воздуха и запечатайте стерильный мешок, скручивая верхнюю часть и применяя пластиковый зажим. Убедитесь, что каждый стерильный мешок правильно помечены пластиной и хорошо идентификации. После передачи каждой ткани культуры вставить в отдельный стерильный мешок, поместите мешки и шесть пластин хорошо с экспериментальной среде в 37 градусов по Цельсию инкубатор.
Через час тщательно упакуйте стерильные пакеты с вставками культуры тканей в пластиковые коробки внутри термической регулируемой коробки, наполненной ионизированной водой при 37 градусах по Цельсию. Вода должна держать органотипические ломтики при физиологической температуре на протяжении всего протокола воздействия ударной волны. Носите стальные защитные сапоги, лабораторное пальто и перчатки во время подготовки ударной трубки и воздействия ударной волны.
Используйте заготовку стержня болт стерильной рамы держателя мешка к ударной трубки дистальной фланга обеспечения того, чтобы центральное отверстие выровнены с выходом ударной трубки. Датчик один, превантукер давления, расположен в средней части управляемой секции, а второй датчик находится в дистальной фланге ударной трубки. Подключите эти предуцаторы давления к осциллоскопу через текущий блок питания источника и включите осциллоскоп.
Убедитесь, что соленоидный клапан ударной трубки и управление потоком закрыты, затем откройте внешнюю линию сжатого воздуха и зарядите соленоидный клапан до 2,5 бар. Откройте сжатый клапан безопасности воздушного цилиндра и медленно откройте регулятор давления, чтобы увеличить давление примерно до пяти бар. Далее, подготовить диафрагмы путем резки 23 микрон толщиной полиэфирных листов на 10 на 10 сантиметров квадратов.
Подготовь ручки из автоклавной ленты и приклейте их к верхней и нижней части каждой диафрагмы. Распоистите одну диафрагму в нарушении и убедитесь, что они сосредоточены. Затем зажимайте диафрагму, используя четыре болта M24 и гайки.
Мода их последовательно по диагонали симметричным образом, обеспечивая при этом диафрагмы морщин бесплатно. Зажим стерильный мешок в вертикальном положении на раме держателя обеспечения того, чтобы поверхность ткани культуры вставить с органотипическими ломтиками гиппокампа сталкивается с выходом ударной трубки и ткани культуры вставить по центру внутри стерильной мешок. Для конфигурации двойной диафрагмы лопнухае давление зависит от дифференциала давления газа между водителем и камерой двойного нарушения.
Таким образом, для диафрагмы лопнуть контролируемым образом, двойной клапан безопасности нарушения открывается вручную, как только целевое давление достигнуто. Положите на ухо защитников и безопасности очки, если еще не носили. Закройте соленоидный клапан.
Включите текущий блок питания источника для получения данных о ударной волне. Манипулируйте ручкой управления потоком на панели управления ударной трубкой, чтобы медленно под давлением раздела громкости драйвера ударной трубки для одной конфигурации диафрагмы или как секции громкости драйвера, так и секции двойного нарушения ударной трубки для двойной конфигурации диафрагмы. Как только диафрагма разрывается, быстро закрывается сжатый поток воздуха с помощью ручки потока и открывается соленоидный клапан.
Идеальное сочетание параметров ударной волны должно быть достаточно, чтобы вызвать повреждение тканей, но не так высока, что это вызывает культуру ткани вставки или стерильные искажения мешок или разрыв. После разоблачения каждого ломтика одной ударной трубки волны, немедленно вернуть его в термической коробке. Затем возьмите следующий стерильный мешок из коробки и зажим его на раме держателя.
Выполните переключатель плавно и быстро, чтобы предотвратить охлаждение экспериментальной среды, как температура ниже 37 может помешать развитию травмы. После того, как все ткани культуры вставки были подвержены ударной волны или фиктивный протокол, вернуть культуру тканей вставляет в свои колодцы в тебя оригинальные шесть пластины хорошо и вернуться в инкубатор до дальнейшего изображения. Это изображение является репрезентативным примером ударной волны, полученной с использованием 23 микрон толщиной полиэфирной пленки с 55 килопаскаль пик чрезмерного давления.
Скорость ударной волны составила 440 метров в секунду. Оба 50 и 55 килопаскаль пик давления ударных волн вызвало значительные травмы, которые развивались на протяжении 72 часов протокола по сравнению с фиктивной группы. Травма, полученная в результате воздействия 55-килограммовой пиковой волны давления, была значительно выше, чем после 50 килопаскаль в 48 часов и 72 часа, демонстрируя, что развитие травмы пропорционально интенсивности ударной волны.
На этом снимке показан кусочек через 72 часа после взрыва на 50 килопаскалях. Виден высокий уровень диффузной травмы. Травма более выражена после 55-килограммового пика давления взрыва.
На этом изображении флуоресценции пропидия йодид показан органотипический кусочек из фиктивного эксперимента. Фиктивный срез показывает низкий уровень флуоресценции. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы сохранить асептический метод во всем, чтобы избежать загрязнения тканей и манипулировать культурами тканей быстро, но очень мягко, чтобы избежать непреднамеренного повреждения клеток.
После этой процедуры, другие методы, такие как иммунофлуоресценции окрашивания могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, как то, что механизмы смерти клеток, участвующих в взрыве индуцированной черепно-мозговой травмы? Этот метод позволяет высокой пропускной способности анализ для исследователей в области нейропротекторной изучить потенциал для препаратов для предотвращения распространения клеточной смерти и мозговой ткани после воздействия взрывных ударных волн.
