Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la lesión cerebral traumática dañina y se puede utilizar para detectar fármacos neuroprotectores antes del uso de modelos más complejos en Vivo. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un instrumento de laboratorio para exponer el tejido cerebral en masa Vitro a una onda de choque utilizando un protocolo simple y de alto rendimiento que permite la creación de una lesión reproducible. En primer lugar, inserte anillos estériles de acero inoxidable hechos a medida en los pozos de una placa de seis pozos.
A continuación, agregue un medio experimental precalecido sin suero con yoduro de propidium a los pozos asegurando que el nivel de medio no alcance por encima de la muesca del anillo. Transfiera la placa a la incubadora durante una hora para asegurarse de que el medio está a 37 grados celsius antes de que se transfieran los insertos de cultivo de tejido. Después de una hora, transfiera los insertos de cultivo de tejido con rodajas organotípicas de sus platos de crecimiento a los anillos en el plato de seis pozos.
Haga un punto en el borde de la plaquita en la posición de las tres en punto con un rotulador permanente para facilitar la devolución de las plaquitas a su posición original, luego etiquete cada placa de seis pozos con un nombre y fecha únicos y haga un mapa de los pozos de cada plato, nombrando cada pozo con una letra y cada rebanada en el pozo con un número para que cada rebanada tenga un identificador único. Incubar a 37 grados centígrados durante una hora para asegurarse de que las rodajas estén a 37 grados centígrados inmediatamente antes de la toma de imágenes. Una hora después de transferirse al medio experimental, evalúe el estado de las rebanadas mediante imágenes rápidas de cada rebanada de forma individual y secuencial bajo baja potencia.
Utilice un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro de excitación y emisión adecuado idealmente en una habitación oscura o una habitación con luz tenue. Mantenga la tapa de la placa cuando realice imágenes. Es posible que se acumule algo de condensación en el interior de la tapa.
Si esto sucede, utilice brevemente un secador de pelo en el ajuste bajo en el exterior de la tapa. Asegúrese de que las condiciones de diagnóstico por imágenes sean idénticas en días diferentes y entre experimentos. Al inicio, las rebanadas sanas muestran muy poca tinción fluorescente.
Los cortes que exhiben áreas de manchas rojas densas indican una viabilidad comprometida y deben excluirse de un análisis posterior. Para comparar, aquí se muestra la fluorescencia de la rebanada lesionada por explosión a las 72 horas. Inmediatamente después de la toma de imágenes, retire un inserto de cultivo de tejido de la placa de seis pozos y transfiera cuidadosamente el inserto a una bolsa de polietileno estéril que contenga 20 mililitros de medio experimental precalentado burbujeado con 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono.
Retire con cuidado las burbujas de aire y selle la bolsa estéril girando la parte superior y aplicando una abrazadera de plástico. Asegúrese de que cada bolsa estéril esté correctamente etiquetada con la placa y bien la identificación. Después de transferir cada inserto de cultivo de tejido a una bolsa estéril individual, coloque las bolsas y las placas de seis pozos con medio experimental en la incubadora de 37 grados Celsius.
Después de una hora, empaquete cuidadosamente las bolsas estériles con los insertos de cultivo de tejido en cajas de plástico dentro de una caja regulada térmica llena con el agua ionizada a 37 grados centígrados. El agua debe mantener las rodajas organotípicas a temperatura fisiológica durante todo el protocolo de exposición a la onda de choque. Use botas protectoras de punta de acero, una capa de laboratorio y guantes durante la preparación del tubo de choque y la exposición a la onda de choque.
Utilice una barra de obse inferior para atornillar el marco del soporte de la bolsa estéril a la brida distal del tubo de choque, asegurándose de que el orificio central esté alineado con la salida del tubo de choque. El sensor uno, un transductor de presión, se encuentra en la parte media de la sección impulsada, y el sensor dos está en la brida distal del tubo de choque. Conecte estos transductores de presión a un osciloscopio a través de una unidad de alimentación de fuente de corriente y encienda el osciloscopio.
Asegúrese de que la válvula solenoide del tubo de choque y el control de flujo estén cerrados, luego abra la línea de aire comprimido externo y cargue la válvula solenoide a 2.5 bar. Abra la válvula de seguridad del cilindro de aire comprimido y abra lentamente el regulador de presión para aumentar la presión a aproximadamente cinco bar. A continuación, prepare los diafragmas cortando láminas de poliéster de 23 micras de espesor en cuadrados de 10 por 10 centímetros.
Prepare las asas de la cinta de autoclave y péguelas en la parte superior e inferior de cada diafragma. Coloque un diafragma en la brecha y asegúrese de que estén centrados. A continuación, sujete el diafragma con cuatro pernos y tuercas M24.
Moda secuencialmente de una manera diagonalmente simétrica mientras se asegura de que los diafragmas están libres de arrugas. Sujete una bolsa estéril en posición vertical en el marco del soporte asegurando que la superficie del inserto de cultivo de tejido con las rebanadas organotípicas del hipocampo esté frente a la salida del tubo de choque y el inserto de cultivo de tejido esté centrado dentro de la bolsa estéril. Para la configuración de doble diafragma, la presión de ráfaga depende del diferencial de presión de gas entre el conductor y la cámara de doble brecha.
Por lo tanto, para que los diafragmas estallen de forma controlada, la válvula de seguridad de doble rotura se abre manualmente una vez que se alcanzan las presiones objetivo. Ponte protectores de oídos y gafas de seguridad si aún no estás desgastado. Cierre la electroválvula.
Encienda la unidad de alimentación de la fuente actual para adquirir los datos de onda de choque. Manipule la perilla de control de flujo en el panel de control del tubo de choque para presurizar lentamente la sección de volumen del conductor del tubo de choque para la configuración de diafragma único o tanto la sección de volumen del conductor como la sección de doble brecha del tubo de choque para la configuración de doble diafragma. Tan pronto como se rompa el diafragma, cierre rápidamente el flujo de aire comprimido con la perilla de flujo y abra la válvula solenoide.
La combinación ideal de parámetros de onda de choque debe ser suficiente para causar lesiones tisulares, pero no tan alta que cause inserción de cultivo de tejido o distorsión o ruptura de bolsa estéril. Después de exponer cada rebanada a una sola onda de tubo de choque, devuélvala inmediatamente a la caja regulada térmicamente. A continuación, tome la siguiente bolsa estéril de la caja y fíjtela en el marco del soporte.
Realice el interruptor suavemente y rápidamente para evitar el enfriamiento del medio experimental, ya que las temperaturas inferiores a 37 pueden interferir con el desarrollo de lesiones. Una vez que todos los insertos de cultivo de tejido han sido expuestos a una onda de choque o protocolo falso, devolver los insertos de cultivo de tejido a sus pozos en la placa original de seis pozos y volver a la incubadora hasta más imágenes. Esta imagen es un ejemplo representativo de una onda de choque obtenida utilizando una película de poliéster de 23 micras de espesor con sobrepresión de pico kilopascale de 55 kilopascales.
La velocidad de onda de choque fue de 440 metros por segundo. Tanto las ondas de choque de sobrepresión de pico de 50 y 55 kilopascales causaron lesiones significativas que se desarrollaron a lo largo del protocolo de 72 horas en comparación con el grupo falso. La lesión resultante de una exposición a ondas de sobrepresión máxima kilopascale de 55 kilopascales fue significativamente mayor que después de 50 kilopascales a las 48 horas y 72 horas, lo que demuestra que el desarrollo de la lesión es proporcional a la intensidad de la onda de choque.
Esta imagen muestra una rebanada 72 horas después de una explosión kilopascale de 50. Un alto nivel de lesión difusa es visible. La lesión es más pronunciada después de una explosión de sobrepresión pico kilopascale de 55 kilopascales.
Esta imagen de fluorescencia de yoduro propidium muestra una rebanada organotípica de un experimento falso. La rebanada falsa muestra niveles bajos de fluorescencia. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener una técnica aséptica en todo momento para evitar la contaminación del tejido y manipular los cultivos de tejidos rápidamente pero muy suavemente para evitar daños celulares no intencionales.
Después de este procedimiento, otros métodos como la tinción de inmunofluorescencia se pueden realizar con el fin de responder a preguntas adicionales como ¿cuáles son los mecanismos de muerte celular involucrados en la lesión cerebral traumática inducida por la explosión? Esta técnica permite un ensayo de alto rendimiento para los investigadores en el campo de la neuroprotección para explorar el potencial de fármacos para prevenir la propagación de la muerte celular y el tejido cerebral después de la exposición a ondas de choque.
