Нейтрофилов Изоляция протокола

Нейтрофилы являются одними из первых клеток, чтобы прибыть на место воспалительного иммунного ответа, а также их функции и механизмы хорошо изучены в лабораторных условиях. Мы демонстрируем стандартный градиент плотности метод разделения, чтобы изолировать нейтрофилов человека из цельной крови с использованием коммерчески доступных раздела сред.

Нейтрофилов полиморфноядерных гранулоцитов (PMN) являются наиболее распространенными лейкоцитов в организме человека и одним из первых клетках, чтобы прибыть на место воспалительного иммунного ответа. Из-за их ключевую роль в воспалении, нейтрофилов функции, такие как передвижение, продукции цитокинов, фагоцитоз, и опухоль боевой ячейки хорошо изучена. Чтобы охарактеризовать специфические функции нейтрофилов, чистый, быстрый и надежный метод, отделяющий их от других клеток крови желательно в лабораторных исследованиях, тем более, что нейтрофилы являются короткоживущими и должны быть использованы в течение 2-4 часов после сбора. Здесь мы демонстрируем стандартный градиент плотности метод разделения, чтобы изолировать нейтрофилов человека из цельной крови с использованием коммерчески доступных разделение средств массовой информации, что представляет собой смесь натрия и metrizoate Декстран 500. Процедура состоит из слоев цельной крови в среднесрочной градиента плотности, центрифугирование, отделение слоя нейтрофилов, и лизиса остаточных эритроцитов. Затем клетки промывают, рассчитывали, и ресуспендировали в буфере для желаемой концентрации. При правильном выполнении этого метода было показано, что выход образцы> 95% нейтрофилов с> 95% жизнеспособность.

Нейтрофилов Изоляция протокола

1. Довести все реагенты до комнатной температуры.
2. Сбор 5,0 мл нейтрофилов изоляции СМИ в центрифуге трубки. Тщательно слой 5,0 мл крови за разделение средств массовой информации. Данный шаг следует выполнять медленно и осторожно, и с кончика пипетки близко к поверхности, средств массовой информации, чтобы избежать смешивания крови и средств массовой информации.
3. Центрифуга при 500 RCF в течение 35 минут при температуре 20-25 ° C. Кровь должна выделить на 6 отдельных полос: плазма, моноцитов, изоляция СМИ, нейтрофилы, больше СМИ изоляции и красных клеток крови гранул (рис. 1). Если эти группы не ясны, процесс разделения не было чистым и необходимо будет повторить.
4. Аккуратно снимите верхнюю три слоя (плазма, моноциты, и изоляции средств массовой информации) с помощью пипетки. Утилизация этих слоев.
5. Тщательно пипеткой слой нейтрофилов и все средства массовой информации изоляции под нейтрофилов. Место раствор в чистую пробирку центрифуги.
6. Развести нейтрофилов решение до 10 мл HBSS без Са ² + / Mg ² +. Обратить трубку несколько раз, чтобы приостановить клеток.
7. Центрифуга нейтрофилов решение при 350 RCF течение 10 минут. Красный шарик должен присутствовать на дне пробирки, содержащие нейтрофилов и остаточной красных кровяных телец (эритроцитов). Удалить супернатант с пипеткой осторожно, чтобы шарик не нарушается.
8. Для лизиса остаточных эритроцитов, добавляют 2 мл красного буфера лизиса клеток к трубе. Для ресуспендирования гранул, вихревые флаконе установка 3-4. Избегайте увеличения вихревой настройки выше 4, так как это может привести к активации нейтрофилов. Это может быть необходимо, чтобы вихрь в течение нескольких секунд, или "пульс" вихрь, чтобы растворить гранулы.
9. Центрифуга трубке при 250 RCF в течение 5 мин. Удалить супернатант с пипеткой. Повторите лизировать процесс, если требуется.
10. Добавить 500 мкл HBSS без Са ² + / Mg ² + в каждую пробирку. Опять же, вихрь для ресуспендирования гранул в установке 3-4. Развести в 10 мл HBSS без Са ² + / Mg ² +.
11. Центрифуга труб при 250 RCF в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и выбросьте.
12. Ресуспендируют осадок в 250 мкл HBSS / HSA Решение (2% HSA). Ячейки могут быть посчитаны и доводят до нужной концентрации.

Разделение градиента плотности метод используется для изоляции нейтрофилов человека из цельной крови с использованием смеси натрия metrizoate и Декстран 500. Этот метод основан на мононуклеарных лейкоцитов метод разделения Boyum (1968), который был модифицирован для нейтрофилов разделения Ферранте и стринги (1980).

После сбора от донора, кровь может быть антикоагулянтом ЭДТА, цитрат или гепарин. Так как они недолговечны, нейтрофилов следует использовать в течение 2-4 часов после сбора. Процедура состоит из слоев цельной крови в среднесрочной градиента плотности, центрифугирование, отделение слоя нейтрофилов, и лизиса остаточных эритроцитов. Затем клетки промывают, рассчитывали, и ресуспендировали к желаемой концентрации.

Если шесть полос не являются отдельными после первого шага центрифугирования, процесс разделения не была чистой и необходимо будет повторить. Для четкого разделения, убедитесь, что выделение средств массовой информации еще не истек, или загрязнены. Разделение может быть неудачным, если кровь донора потребляемого алкоголя или лекарств в 72 часов до забора крови.

Для предотвращения активации нейтрофилов во время процедуры разделения, то лучше использовать HBSS без Ca2 + / Mg2 +, так как ионы Было показано, что премьер клеток. Ресуспендирования гранул также должны быть выполнены медленно, и вихрь настройки должны храниться в низкой и средней дальности, так что клетки не активируются.

При правильном выполнении этого метода было показано, что выход образцы> 95% нейтрофилов с> 95% жизнеспособность. Чистота и жизнеспособность можно оценить с помощью маркировки клеток с нейтрофилами специфическим маркером CD66b и трипанового синего красителя исключения.

Финансирование из NIH R01 HL56621.