Method Article
Нейтрофилы являются одними из первых клеток, чтобы прибыть на место воспалительного иммунного ответа, а также их функции и механизмы хорошо изучены в лабораторных условиях. Мы демонстрируем стандартный градиент плотности метод разделения, чтобы изолировать нейтрофилов человека из цельной крови с использованием коммерчески доступных раздела сред.
Нейтрофилов полиморфноядерных гранулоцитов (PMN) являются наиболее распространенными лейкоцитов в организме человека и одним из первых клетках, чтобы прибыть на место воспалительного иммунного ответа. Из-за их ключевую роль в воспалении, нейтрофилов функции, такие как передвижение, продукции цитокинов, фагоцитоз, и опухоль боевой ячейки хорошо изучена. Чтобы охарактеризовать специфические функции нейтрофилов, чистый, быстрый и надежный метод, отделяющий их от других клеток крови желательно в лабораторных исследованиях, тем более, что нейтрофилы являются короткоживущими и должны быть использованы в течение 2-4 часов после сбора. Здесь мы демонстрируем стандартный градиент плотности метод разделения, чтобы изолировать нейтрофилов человека из цельной крови с использованием коммерчески доступных разделение средств массовой информации, что представляет собой смесь натрия и metrizoate Декстран 500. Процедура состоит из слоев цельной крови в среднесрочной градиента плотности, центрифугирование, отделение слоя нейтрофилов, и лизиса остаточных эритроцитов. Затем клетки промывают, рассчитывали, и ресуспендировали в буфере для желаемой концентрации. При правильном выполнении этого метода было показано, что выход образцы> 95% нейтрофилов с> 95% жизнеспособность.
Нейтрофилов Изоляция протокола
Разделение градиента плотности метод используется для изоляции нейтрофилов человека из цельной крови с использованием смеси натрия metrizoate и Декстран 500. Этот метод основан на мононуклеарных лейкоцитов метод разделения Boyum (1968), который был модифицирован для нейтрофилов разделения Ферранте и стринги (1980).
После сбора от донора, кровь может быть антикоагулянтом ЭДТА, цитрат или гепарин. Так как они недолговечны, нейтрофилов следует использовать в течение 2-4 часов после сбора. Процедура состоит из слоев цельной крови в среднесрочной градиента плотности, центрифугирование, отделение слоя нейтрофилов, и лизиса остаточных эритроцитов. Затем клетки промывают, рассчитывали, и ресуспендировали к желаемой концентрации.
Если шесть полос не являются отдельными после первого шага центрифугирования, процесс разделения не была чистой и необходимо будет повторить. Для четкого разделения, убедитесь, что выделение средств массовой информации еще не истек, или загрязнены. Разделение может быть неудачным, если кровь донора потребляемого алкоголя или лекарств в 72 часов до забора крови.
Для предотвращения активации нейтрофилов во время процедуры разделения, то лучше использовать HBSS без Ca2 + / Mg2 +, так как ионы Было показано, что премьер клеток. Ресуспендирования гранул также должны быть выполнены медленно, и вихрь настройки должны храниться в низкой и средней дальности, так что клетки не активируются.
При правильном выполнении этого метода было показано, что выход образцы> 95% нейтрофилов с> 95% жизнеспособность. Чистота и жизнеспособность можно оценить с помощью маркировки клеток с нейтрофилами специфическим маркером CD66b и трипанового синего красителя исключения.
Финансирование из NIH R01 HL56621.
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen | ||
Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Group | ||
Centrifuge | Tool | |||
Vortexer | Tool | |||
Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
Syringe Filter | Other | EMD Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены