Разделение и дифференциальная характеристика кишечных микробных внеклеточных везикул у чувствительных к соли крыс в условиях диеты с высоким содержанием соли

Протокол описывает выделение кишечных микробных EV от чувствительных к соли крыс, которых кормили HSD с использованием центрифугирования градиента плотности. ВВ характеризовали с помощью отслеживания наночастиц, анализов TEM, LPS/BCA и секвенирования 16S рРНК для анализа размера, морфологии, состава и происхождения микробиоты.

Высокое потребление соли является основным фактором риска развития гипертонии, и ее основной механизм может быть тесно связан с внеклеточными везикулами (ВВ), секретируемыми микробиотой кишечника. Эти ВВ, вырабатываемые микробиотой кишечника, содержат различные биологически активные компоненты, которые могут играть решающую роль в развитии гипертонии, вызванной диетой с высоким содержанием соли (HSD). Чтобы исследовать этот механизм, мы разработали эффективный метод экстракции, основанный на центрифугировании с градиентом плотности, для выделения ВВ из микробиоты кишечника чувствительных к соли крыс, которых кормили HSD. С помощью анализа размера частиц, просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и обнаружения липополисахаридов (ЛПС) мы определили градиентное распределение ВВ кишечной микробиоты и добились точной экстракции. Кроме того, секвенирование гена 16S рРНК было использовано для анализа происхождения и различий в составе ВВ между нормальной группой и группой HSD, что выявило влияние высокого потребления соли на генетические характеристики ВВ кишечной микробиоты. Это исследование предоставляет ценные инструменты и научные знания о механизмах микробиоты кишечника, лежащих в основе солевой гипертензии, и предлагает новые перспективы для профилактики и лечения связанных с ней заболеваний.

Микробиота кишечника, также известная как микрофлора микробиоты кишечника или микроэкология кишечника, представляет собой комплекс из десятков тысяч микроорганизмов, расположенных в биологическом желудочно-кишечном тракте и играющих важнейшую роль в поддержании здоровья человека¹. В последние годы в ходе дальнейших исследований было установлено, что микробиота кишечника может продуцировать внеклеточные везикулы (ВВ)². ВВ представляют собой небольшие везикулы, выделяемые клетками, которые переносят различные молекулы в клетке, такие как белки, нуклеиновые кислоты и липиды ^3,4. Они могут взаимодействовать с другими микробами⁵, эпителиальными клетками кишечника и даже отдаленными тканями и органами⁶, тем самым влияя на здоровье человеческого организма ^7,8. Существует тесная связь между ВВ, вырабатываемыми этой кишечной микробиотой, и рационом питания⁹.

ВВ, вырабатываемые кишечной микробиотой, могут быть важными факторами, с помощью которых диета с высоким содержанием соли (HSD) влияет на здоровье организма. HSD не только напрямую нарушает баланс кишечной^{микробиоты10}, что приводит к значительному сокращению количества полезных бактерий (таких как Lactobacillus)¹¹, но и способствует размножению вредных бактерий (таких как Bacteroides и т. д.)¹². Этот дисбаланс снижает барьерную функцию кишечника и увеличивает риск воспаления кишечника. Кроме того, HSD также влияет на кислотно-щелочной баланс и всасывание питательных веществ в кишечнике, изменяя метаболическую активность¹³ кишечной микробиоты, например, снижая выработку короткоцепочечных жирных кислот^14,15 с множественными физиологическими функциями.

Эти изменения не только влияют на здоровье кишечника, но и могут косвенно регулировать производство и высвобождение ВВ и изменять состав и функцию ВВ. Среда с высоким содержанием соли может влиять на нормальные физиологические функции кишечных клеток, включая высвобождение и транспорт ВВ, тем самым нарушая роль ВВ в передаче межклеточной информации и иммунной регуляции. В то же время воспаление кишечника может способствовать развитию различных ВВ с особыми функциями¹⁶ и распространяться по всему организму через ось кишечник-орган и другими путями ^17,18, что тесно связано с возникновением и развитием гипертонической болезни^19,20, сердечно-сосудистых²¹ и цереброваскулярных заболеваний^22,23, ожирения^24,25, сахарного диабета²⁶ и другие хронические заболевания.

Таким образом, общая цель данного исследования заключалась в разработке эффективного и надежного метода извлечения ВВ из микробиоты кишечника чувствительных к соли крыс, которых кормили HSD, и систематическом изучении их физических свойств, состава и функций. В связи с особенностями значительного повышения артериального давления после диеты с высоким содержанием соли, были отобраны чувствительные к соли крысы и выявлено влияние HSD на микробиоту кишечника EV путем построения эффективного метода экстракции. Метод был основан на центрифугировании с градиентом плотности и сочетал в себе различные методы динамической идентификации, такие как определение размера частиц, измерение LPS/BCA, просвечивающая электронная микроскопия и протеомный анализ. Протокол направлен на выявление влияния HSD на микробиоту кишечника EV и его механизмы при сердечно-сосудистых заболеваниях. Обладая высокой эффективностью, воспроизводимостью и широкой применимостью, этот подход не только является важным инструментом для изучения механизма ВВ кишечной микробиоты при солевой гипертензии, но и закладывает теоретическую основу для разработки стратегий вмешательства в заболевания на основе ВВ. Благодаря этому исследованию мы надеемся открыть новые возможности для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, таких как гипертония^27,28.

Это экспериментальное исследование на животных соответствует соответствующим этическим принципам и международным стандартам. Исследования с участием животных были одобрены Комитетом по благополучию и этике лабораторных животных Университета китайской медицины в Чэнду (учреждение: Университет китайской медицины в Чэнду; номер протокола: 2018-21).

1. Подготовка животных и режим питания

1. Акклиматизировать 6-недельных самцов чувствительных к соли крыс Dahl, масса тела 180-200 г, выращивая при влажности 50% ± 10%; световой цикл 12 ч / 12 ч; 20,0 ± 2,0 °C в течение 1 недели в определенных условиях, свободных от патогенов.
2. Впоследствии разделите крыс поровну на две группы (n = 6). Обеспечьте каждой группе различную диету в течение 6 недель: нормальную солевую диету (NSD) с 0,5% хлорида натрия и HSD с 8% хлорида натрия, которая обычно используется в опубликованных исследованиях 29,30,31. Мыши имели неограниченный доступ к пище и воде на протяжении всего исследования.

2. Мониторинг артериального давления

ПРИМЕЧАНИЕ: Плетизмография хвостовой манжеты использовалась в качестве неинвазивного метода измерения артериального давления, а измерение объемного давления (VPR) использовалось при измерении артериального давления по объему хвостовой крови.

1. Поместите крыс по отдельности в небольшие клетки с опилками, нагретые в течение 10 минут примерно до 37 °C и поместите в специальное ограничительное устройство для грызунов с регулируемым носом и дверцей для входа животных. Поместите крыс на грелку в положение лежа, чтобы поддерживать температуру их тела на уровне 37 °C.
2. Подключите датчик VPR к нижней части хвостового оперения и установите не менее 10 циклов адаптации для стабилизации BP²⁸.
   1. Набейте надувную манжету на корень хвоста и поместите плетизмографический датчик (или фотоэлектрический датчик) внизу. Медленно надувайте до выше систолического давления (обычно 200 мм рт.ст.), а затем медленно отпускайте. Прибор автоматически определяет значение давления исчезновения пульсовой волны (систолическое артериальное давление) и восстановления (диастолическое артериальное давление). Отмерьте 3-5 раз подряд и возьмите среднее значение.
3. Обучите всех крыс приспособиться к процедуре ограничения и проведите это исследование в тихой лаборатории около 9 утра, чтобы свести к минимуму влияние циркадных вариаций.
4. Измеряйте систолическое артериальное давление (САД) и диастолическое артериальное давление (ДАД) через день перед жертвой. Оценка среднего артериального давления (MAP) по САД и ДАД
   MAP = (SBP + 2 DBP)/3

3. Извлечение электромобилей

1. Забор образцов
   1. Смочите стерильный ватный тампон в 75% спирте и с его помощью стимулируйте анальное отверстие крысы. Стимуляция была предназначена для стимуляции перистальтики кишечника и расслабления анального сфинктера, тем самым способствуя дефекации. После того, как кал будет выведен, соберите его с помощью стерильных щипцов в стерильные контейнеры соответствующего размера и немедленно храните при температуре -80 °C.
2. Подготовка образцов
   1. С помощью ложки переложите 5 г кала в предварительно взвешенную центрифужную пробирку объемом 50 мл. Добавьте в пробирку 50 мл предварительно нагретого PBS без эндотоксинов 37 °C (максимальная концентрация образца 10%) и вращайте в течение 30 минут. Охладите высокоскоростную центрифугу до 4 °C.
   2. Центрифугируйте при давлении 8 000 x g в течение 15 минут после симметричного размещения образцов, чтобы центрифуга могла сбалансироваться. После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и перенесите ее в новую стерильную центрифужную пробирку.
   3. Снова центрифугируйте при 8 000 x g в течение 15 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и используйте ее для дальнейшего анализа.
3. Приготовление сырого экстракта
   1. Используйте стерильный фильтрующий блок 0,22 мкм. Поместите фильтрующий блок на лед и крепко удерживайте вакуумный насос. Полученную надосадочную жидкость перенесите в верхнюю часть фильтра. Включите вакуумный насос для сбора отфильтрованных образцов.
   2. Переведите фильтрат в центробежный фильтр (10 кДа, 15 мл), центрифугируйте при 4 °C, 3 000 x g в течение 30 мин и сконцентрируйте образец не менее чем до 1400 μл.
   3. Соберите концентрированный образец и, при необходимости, разбавьте его до 1400 мкл с помощью предварительно охлажденного PBS, не содержащего эндотоксинов. Держите образец на льду сразу после разведения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сырой экстракт можно использовать сразу или хранить при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев.
4. Разделение электромобилей
   1. Подготовьте градиентный буфер A и градиентный буфер B, как описано ниже. Подготовьте буфер за один день, так как для полного растворения соединения требуется несколько часов. Приготовленный буфер можно хранить при температуре 4 °C в течение 6 месяцев.
      1. Приготовление градиентного буфера А: Растворить 0,25 М сахарозы, 6 мМ ЭДТА и 60 мМ Трис в 800 мл воды, не содержащей эндотоксинов, путем перемешивания магнитным миксером с помощью соляной кислоты, скорректированного до 7,4. Разбавьте до 1 л водой, не содержащей эндотоксинов. Используйте бутылочный фильтр 0,22 мкм для фильтрации буфера.
      2. Приготовление градиентного буфера В: Растворить 0,25 М сахарозы, 1 мМ ЭДТА и 10 мМ Трис в 800 мл воды, не содержащей эндотоксинов, путем перемешивания магнитным миксером с pH до 7,4 с помощью соляной кислоты. Разбавляют до 1 л водой, не содержащей эндотоксинов. Используйте бутылочный фильтр длиной 0,22 мкм для фильтрации буфера.
   2. Смешайте 1 объем градиентного буфера А и 5 объемов градиентной среды плотности (среда представляет собой 60% раствор йодиксанола) для приготовления рабочего раствора.
   3. Приготовление раствора йодиксанола (10%, 20%, 40%): Для приготовления 10% раствора йодиксанола смешать 1 единицу рабочего раствора и 4 единицы буфера В; для 20% раствора йодиксанола смешать 2 единицы рабочего раствора и 3 единицы буфера Б; для 40% раствора йодиксанола смешайте 4 единицы рабочего раствора и 1 единицу буфера В. Приготовьте каждый раствор в свежем виде и храните на льду.
      Примечание: Для каждого эксперимента должны быть подготовлены свежие рабочие растворы, и может быть подготовлен дополнительный объем растворов на 10% с учетом экспериментальной ошибки.
   4. Раствор, приготовленный на шаге 3.3.3, смешать с 7 мл градиентной среды плотности до получения 50% раствора йодиксанола.
   5. Чтобы приготовить градиент плотности, добавьте раствор трипанового синего к 40% раствору и 10% (масс./об.) раствору йодиксанола, чтобы обеспечить четкую границу между отдельными слоями.
   6. Перенесите 8 мл 50% раствора йодиксанола на дно тонкостенной полипропиленовой центрифужной пробирки. Наклоните пробирку на 70° и перенесите 8 мл 40% раствора йодиксанола на поверхность жидкости. Добавьте 8 мл 20% раствора йодиксанола, затем 7 мл 10% раствора йодиксанола и, наконец, 2 мл PBS, не содержащего эндотоксинов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка градиента плотности требует практики. Качество градиента плотности оказывает большое влияние на результаты экспериментов. Не ставьте трубку вертикально между различными этапами процесса добавления, так как это отрицательно влияет на качество градиента плотности.
   7. Предварительно охладите центрифугу и поместите подготовленный градиент плотности в ультрацентрифугу. Входные параметры для начала, значения параметров: 100 000 x g, 20 ч, 10 °C.
   8. Для ручного разделения по градиентной плотности медленно набирайте 2 мл раствора из центра поверхности системы, содержащей в общей сложности 34 мл жидкости. Каждые 2 мл являются градиентом, таким образом, решение градиента плотности делится на 17 градиентов.
   9. Переложите фракции плотности в стерильную пробирку с образцом с помощью пипетки и сразу же поместите их на лед. Зажмите трубку центрифуги между большим и указательным пальцами, чтобы она оставалась в вертикальном положении.
5. Утилизация электромобилей
   1. Используя полностью автоматизированную систему экстракции EVs, которая применяет колебания отрицательного давления через систему ультразвуковых колебаний с двойной связью на чипе ультрафильтрации, удаляет примеси нуклеиновых кислот и белков в образце через нанопоры и перехватывает EV, что приводит к обогащению и очистке EVs.
      1. Удалите фильтрат на шаге 3.4.7 и добавьте его в чип ультрафильтрации.
      2. Работайте с прибором в соответствии с инструкциями по прибору и соберите отфильтрованный фильтрат, а именно раствор, обогащенный экзосомами. Основной процесс показан на рисунке 1.

4. Идентификация электромобилей

1. Определение размера и концентрации частиц
   1. Оцените распределение по размерам и дзета-потенциал с помощью счетчика нанокулонометра на основе резистивного импульсного зондирования (RPS). Для этого эксперимента выберите нанопористые чипы с диапазоном измерения 60-200 нм. Кроме того, оцените распределение частиц по размерам и дзета-потенциал EV с помощью счетчика нанобиблиотек.
      1. Возьмите соответствующее количество раствора EVs и разведите его в (1/10, 1/100, 1/10000, 1/10000).
      2. Для тестирования на прибор были нанесены различные разбавления растворов электромобилей.
      3. Для получения более точных данных был выбран мультипликатор разрежения с лучшей стабильностью и повторно протестирован.
2. Анализ ЛПС и ВСА
   1. Анализ BCA: Лизируйте EV с помощью буфера RIPA, а затем разделите белки. Определите содержание белка в EV с помощью набора для определения концентрации белка BCA.
   2. Анализ ЛПС: Используя набор для обнаружения эндотоксинов, добавьте образцы, детектор эндотоксинов и хромогенные в соответствии с инструкциями набора. Измерьте абсорбцию на длине волны 545 нм и рассчитайте экспрессию LPS наружных везикул в соответствии со стандартной кривой.
3. Оценка ПЭМ: Для отрицательного окрашивания и анализа ПЭМ нанесите образцы на люминесцентную медную решетку, покрытую непрерывной углеродной пленкой, и окрасьте 0,75% уранилформиата. Для крио-ЭМ электромобили поглощают в 300-мешную углеродную сетку EM с гидрофильной поверхностью и замораживают в жидком азоте. Наблюдайте и анализируйте сетки с помощью Cryo-TEM и записывайте изображения с увеличением 22 000³².
4. Характеристика белков: Лизируйте EV с помощью буфера RIPA и затем разделите белки. Определите концентрацию белка с помощью набора для анализа белка BCA, отделите равное количество белка от каждого образца с помощью SDS-PAGE и окрасьте раствором синего красителя Кумасси после электрофореза для визуализации белковых профилей^33,34.
5. Секвенирование и анализ S: Извлеките геномную ДНК из образцов кала с помощью набора для экстракции фекальной ДНК. Оценка целостности и концентрации ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле и спектрофотометра. Амплифицируйте V3 - V4 гена 16S рРНК с помощью универсальных праймеров, очистите продукты ПЦР, количественно определите их и секвенируйте на платформе Illumina. Выполнение анализа данных с помощью конвейера QIIME2³⁵.
   1. Классификация вариантов ампликонных последовательностей (ASV) с помощью DADA2 и сопоставление с базой данных Silva с помощью алгоритма VSEARCH. Используйте анализ α-разнообразия для оценки видового богатства и разнообразия в выборках, в основном с использованием таких индексов, как индекс Шеннона и индекс Chao1. Анализ β-разнообразия сравнивает состав микробного сообщества между образцами и обычно визуализируется с помощью анализа главных координат (PCoA). Используйте методы дифференциального анализа, такие как линейный дискриминантный анализ величины эффекта (LEfSe) и анализ вулканических графиков, для идентификации микробных таксонов со значительно различающимися условиями или между группами.

Концентрации ВВ определяли в различных фракциях (рис. 2А). Экспериментальные результаты показали, что концентрация EV демонстрирует типичную нормальную картину распределения в серии решений градиента плотности (рис. 2B). В частности, во фракции 9 концентрация EV достигла наивысшей точки (3,85 x 10⁹), что позволяет предположить, что основная доля распределения EV может составлять 9³⁶.

Для определения содержания белка использовались наборы ВСА, позволяющие оценить содержание белка в разных фракциях (рисунок 2В). В этом методе содержание белка во фракции 9 составляло 0,417 мкг/л, что еще раз демонстрирует распределение ВВ. Поскольку ЛПС является уникальным компонентом грамотрицательных бактерий^37,38, для определения экспрессии ЛПС также использовались наборы для детектирования эндотоксинов (рис. 2D) с целью оценки распределения ВВ в различных фракциях. Результаты эксперимента показали, что в фракциях 9 и 10 экспрессия ЛПС была достоверно выше, чем у других фракций (поглощение для фракции 9 = 0,8086, для фракции 10 = 0,8515), а его распределение показало нормальное распределение, что доказало, что ВВ в основном распределены во фракции 9. Относительно большие количества белка во фракции 9 также наблюдались при гель-электрофорезе SDS-PAGE ВВ, выделенных из различных фракций (рис. 2E).

В этом исследовании EV изучались с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM; Рисунок 2F). С помощью визуализации с высоким разрешением, полученной с помощью ПЭМ, удалось четко визуализировать морфологическую структуру ВВ, в которой представлены круглые мембраноподобные структуры, что имеет решающее значение для понимания биологии ВВ.

Изменения артериального давления определяли в группах НСД и НСД через 2 месяца выращивания в НСД и НСД крыс. Мы видим, что САД (рис. 3A), ДАД (рис. 3B) и МБП (рис. 3C) были значительно увеличены в группе HSD, что указывает на то, что модель гипертензии в этом исследовании была успешно построена.

В этом исследовании концентрация ВВ была обнаружена в разных группах (рис. 3D), и результаты показали, что концентрация ВВ в группе HSD была значительно выше, чем у крыс в группе NSD. Это говорит о том, что HSD влияет на уровень ВВ, возможно, из-за изменений в составе микробиоты кишечника, из которой происходят ВВ.

Затем в этом исследовании был измерен размер частиц EV. Результаты измерений показывают, что размер частиц EV преимущественно составляет около 60 нм (рисунок 3E), а размер частиц группы HSD немного ниже, чем у группы NSD. Измеренные данные предоставляют важную информацию для оценки распределения по размерам и однородности электромобилей, облегчая последующий экспериментальный дизайн и разработку приложений.

Затем, в этом исследовании, была изучена величина экспрессии ЛПС ВВ в группе HSD и группе NSD (рис. 3F). Результаты показали, что экспрессия ЛПС у ВВ в группе HSD также была значительно выше, чем в группе NSD. Это может быть связано с увеличением количества грамотрицательных бактерий в кишечной микробиоте, полученной из экзовезикул, или с более высокой концентрацией ВВ в группе HSD, чем в группе NSD.

Чтобы еще больше подтвердить различия между ВВ в группах HSD и NSD, в этом исследовании изучалась полученная микробиота кишечника и проводилось секвенирование 16S рРНК образцов ВВ из групп NSD и HSD для дальнейшего уточнения влияния HSD на ВВ в микробиоте кишечника у мышей.

Анализ α-разнообразия показал, что разнообразие кишечной микробиоты было значительно снижено в группе HSD, при этом снизились индексы Шеннона и ACE (рис. 4A). β-Анализ разнообразия, основанный на PCoA (рис. 4B), различал микробные фенотипы между группами на уровне ASV. Вмешательство с высоким содержанием соли частично обратило вспять фенотипические изменения микрофлоры кишечника и обнаружило значимые различия в составе микробиоты кишечника, полученной из внешних везикул, между группами (p = 0,001).

После фильтрации бактерий с низкой численностью и стандартизации данных, таксономическая аннотация идентифицировала различные диапазоны микробных сообществ в образцах. Микробиота кишечника, полученная методом экзовезикул, в основном состояла из протеобактерий (93,19%), Firmicutes (4,57%) и Bacteroidota (1,19%; Рисунок 4С). В группе HSD значительно увеличивалось количество наружных пузырьков Firmicutes (рисунок 4D). На уровне рода результаты показали, что такие роды, как Nevskia и Acinetobacter , были более многочисленны в группе NSD, в то время как Delftia, Burkholderia_Ca и Clostridium_sen были более многочисленны в группе HSD (рис. 4E). Кроме того, в этом исследовании также использовались тепловые карты, чтобы показать различия в ВВ кишечной микробиоты между группой HSD и группой NSD (рис. 4F). После вмешательства с высоким содержанием соли численность некоторых бактерий, Delftia и Burkholderia_Ca, значительно увеличилась, а Nevskia и Acinetobacter значительно уменьшилась (рис. 4G). В заключение следует отметить, что вмешательство с высоким содержанием соли значительно изменило разницу в продукции ВВ, полученных из кишечной микрофлоры, в основном потому, что оно изменило распределение их родительских бактерий, а основными характеристиками были уменьшение разнообразия, изменения в равновесной структуре и изменения в численности различных бактерий.

Рисунок 1: Экстракция и характеристика наружных везикул, полученных из кишечных микробов. (A) Технологическая схема экстракции наружных везикул. (В) Характеристика наружных пузырьков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Базовая характеристика EV и анализ локального градиента плотности. (A) Измерения концентрации экстравезикул и размера частиц с различными градиентами плотности (нм; частицы/мл). (B) Сравнение концентраций наружных пузырьков раствора по градиенту плотности 3 - 16 (частиц/мл). (C) Определение содержания белка в растворе на градиенте плотности 6-12 с помощью набора BCA (μг/мл). (D) Решение для измерения экспрессии ЛПС по градиенту плотности 7-11 с помощью набора для детекции эндотоксинов (Abs). (Д) Растворы с градиентом плотности 6 - 12 подвергали гель-электрофорезу SDS-PAGE и окрашивали бриллиантовым синим цветом Кумасси. (F) TEM: Масштабная линейка составляет 100 нм; Отдельные пузырьки показаны на изображении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Анализ изменений артериального давления и ВВ при различных диетах. а) СБП; (B) DBP; (C) ПМБ; (D) Сравнение концентраций внешних везикул в группах HSD и NSD; (E) Сравнение размеров наружных везикул в группах HSD и NSD. (F) ЛПС в пробах НСД и НСД, определяемых методом спектрофотометрии. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, а NS означает отсутствие значимости, t-критерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Анализ теста на 16s рРНК при различных диетах. (A) Анализ разнообразия α; (В) Анализ главных координат; (C) обилие микробиоты кишечника на уровне типов; (D) изменения в бактериях на уровне типов; (E) Результат LEfSe; (F) анализ кластерной тепловой карты на основе дифференциальных родов бактерий; (G) Изменения в бактериях рода. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, а NS означает отсутствие значимости, t-критерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В этом исследовании мы сосредоточились на ВВ микробиоты кишечника у чувствительных к соли крыс на HSD и добились ряда ключевых достижений. Во-первых, был успешно разработан эффективный метод экстракции, основанный на центрифугировании с градиентом плотности, для выделения ВВ из чувствительной к соли микробиоты кишечника крыс на HSD, и большинство компонентов, не относящихся к ВВ, были выделены с помощью тщательного, стандартизированного экспериментального процесса на животных и обработки образцов. Метод центрифугирования с использованием градиента плотности для экстракции EVs является высокоэффективным и воспроизводимым, лучше, чем обычный метод ультрацентрифугирования, и может лучше сохранить целостность и функциональность EVs, обеспечивая качество образца и осуществимость исследования.

Во-вторых, электромобили были всесторонне идентифицированы с помощью различных динамических технологий: определение размера и концентрации частиц указывает на то, что электромобили имеют определенное распределение по размерам; Измерения ЛПС и БЦА позволяют количественно оценить содержание белка и экспрессию ЛПС в ВВ; ПЭМ ясно показывает морфологическую структуру электромобилей; А характеристики белка определяют белковый спектр. Эти результаты идентификации всесторонне раскрывают физические и биохимические свойства электромобилей, обеспечивая надежную информационную поддержку для последующих исследований.

Кроме того, технология секвенирования гена 16S рРНК с использованием углубленного анализа различий между происхождением и составом нормальных ВВ и ВВ HSD, а также анализа разнообразия α и анализа разнообразия β показала, что высокое потребление соли значительно влияет на генетические характеристики кишечных микробных ВВ, включая структуру микробного сообщества, видовое богатство и разнообразие, чтобы более комплексно разрешить влияние диеты с высоким содержанием соли на ВВ кишечной микробиоты. Предоставляет несколько уровней доказательств для механистических исследований.

Несмотря на то, что этот метод имеет некоторые преимущества по сравнению с обычным методом центрифугирования с превышением скорости с точки зрения восстановления экзосом и целостности, все же существуют некоторые ограничения, такие как высокий спрос на образцы и сложность отличия хозяина от источника микрофлоры. Тем не менее, по сравнению с существующими методами, центрифугирование с градиентом плотности имеет уникальные преимущества в поддержании функциональной целостности экзосом, что обеспечивает надежную техническую поддержку для дальнейшего исследования механизма, с помощью которого диета с высоким содержанием соли влияет на кровяное давление хозяина через кишечную флору. Более того, для нечеткой градиентной стратификации, возникшей во время эксперимента, мы также улучшили ее, увеличив время центрифугирования или заменив ротор с более высокой производительностью.

В будущем мы сможем продолжить изучение механизма развития ВВ кишечной микробиоты при гипертонии, вызванной диетой с высоким содержанием соли, особенно ее взаимодействие с иммунной системой, такой как провоспалительные Т-клетки ^39,40; или использовать продукты растительного происхождения для вмешательства в микробиоту кишечника^{EVs 41,42}, дальнейшего вмешательства в заболевания и изучения их роли в регулировании метаболизма хозяина и иммунного ответа.

В заключение следует отметить, что данное исследование не только предоставляет важный инструмент для изучения механизма солевой гипертензии кишечной микробиоты через модель чувствительных к соли крыс, углубляет понимание взаимосвязи между HSD, кишечной микробиотой и ВВ, а также открывает новый способ профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, таких как гипертония, обеспечивает уникальную перспективу для изучения взаимодействия диеты, микробов и хозяина.

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82205240), Фондом естественных наук провинции Сычуань (2025ZNSFSC1836) и Клиническим базовым проектом Ортопедической больницы провинции Сычуань (PY202414).