Separação e Caracterização Diferencial de Vesículas Microbianas Extracelulares Intestinais em Ratos Sensíveis ao Sal sob Condições de Dieta Rica em Sal

O protocolo descreve o isolamento de EVs microbianos intestinais de ratos sensíveis ao sal alimentados com HSD usando centrifugação por gradiente de densidade. Os EVs foram caracterizados por rastreamento de nanopartículas, ensaios TEM, LPS/BCA e sequenciamento de rRNA 16S para analisar o tamanho, morfologia, composição e origem da microbiota.

A alta ingestão de sal é um importante fator de risco para hipertensão, e seu mecanismo subjacente pode estar intimamente ligado às vesículas extracelulares (EVs) secretadas pela microbiota intestinal. Esses EVs, produzidos pela microbiota intestinal, carregam vários componentes bioativos que podem desempenhar um papel crucial no desenvolvimento da hipertensão induzida por uma dieta rica em sal (HSD). Para investigar esse mecanismo, desenvolvemos um método de extração eficiente baseado na centrifugação por gradiente de densidade para isolar EVs da microbiota intestinal de ratos sensíveis ao sal alimentados com HSD. Por meio da análise do tamanho das partículas, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e detecção de lipopolissacarídeo (LPS), identificamos a distribuição do gradiente dos EVs da microbiota intestinal e obtivemos uma extração precisa. Além disso, o sequenciamento do gene 16S rRNA foi empregado para analisar a origem e as diferenças de composição dos EVs entre os grupos normal e HSD, revelando o impacto da alta ingestão de sal nas características genéticas dos EVs da microbiota intestinal. Este estudo fornece ferramentas valiosas e insights científicos sobre os mecanismos da microbiota intestinal subjacentes à hipertensão induzida pelo sal e oferece novas perspectivas para a prevenção e tratamento de doenças relacionadas.

A microbiota intestinal, também conhecida como microbiota intestinal ou microecologia intestinal, é um complexo de dezenas de milhares de microrganismos localizados no trato gastrointestinal biológico e desempenha um papel crucial na manutenção da saúde humana¹. Nos últimos anos, com mais pesquisas, descobriu-se que a microbiota intestinal pode produzir vesículas extracelulares (EVs)². As EVs são pequenas vesículas liberadas pelas células, que carregam várias moléculas na célula, como proteínas, ácidos nucléicos e lipídios ^3,4. Eles podem interagir com outros micróbios⁵, células epiteliais intestinais e até tecidos e órgãos distantes⁶, afetando assim a saúde do corpo humano ^7,8. Existe uma estreita ligação entre os EVs produzidos por essa microbiota intestinal e a dieta⁹.

Os EVs produzidos pela microbiota intestinal podem ser agentes significativos através dos quais uma dieta rica em sal (HSD) afeta a saúde do corpo. A HSD não apenas perturba diretamente o equilíbrio da microbiota intestinal¹⁰, levando a uma redução significativa no número de bactérias benéficas (como Lactobacillus) ¹¹, mas também promove a proliferação de bactérias nocivas (como Bacteroides, etc.)¹². Esse desequilíbrio reduz a função da barreira intestinal e aumenta o risco de inflamação intestinal. Além disso, uma HSD também afeta ainda mais o equilíbrio ácido-base e a absorção de nutrientes no intestino, alterando as atividades metabólicas¹³ da microbiota intestinal, como a redução da produção de ácidos graxos de cadeia curta^14,15 com múltiplas funções fisiológicas.

Essas mudanças não apenas afetam a saúde intestinal, mas também podem regular indiretamente a produção e liberação de EVs e alterar a composição e a função do EV. O ambiente com alto teor de sal pode afetar as funções fisiológicas normais das células intestinais, incluindo a liberação e o transporte de EVs, perturbando assim o papel dos EVs na transmissão de informações intercelulares e na regulação imunológica. Ao mesmo tempo, a inflamação intestinal pode promover uma variedade de EVs com funções especiais¹⁶ e se espalhar para todo o corpo através do eixo do órgão intestinal e de outras formas^17,18, o que está intimamente relacionado à ocorrência e desenvolvimento de hipertensão^19,20, doenças cardiovasculares²¹ e cerebrovasculares^22,23, obesidade^24,25, diabetes²⁶ e outras doenças crônicas.

Portanto, o objetivo geral deste estudo foi desenvolver um método eficiente e confiável para extrair EVs da microbiota intestinal de ratos sensíveis ao sal alimentados com HSD e estudar sistematicamente suas propriedades físicas, composição e funções. Devido às características do aumento significativo da pressão arterial após uma dieta rica em sal, ratos sensíveis ao sal foram selecionados e revelaram o efeito do HSD na microbiota intestinal EV através da construção de um método de extração eficiente. O método foi baseado na centrifugação do gradiente de densidade e combinou várias técnicas de identificação dinâmica, como detecção de tamanho de partícula, medição de LPS/BCA, microscopia eletrônica de transmissão e análise proteômica. O protocolo visa revelar os efeitos da HSD na microbiota intestinal EV e seus mecanismos nas doenças cardiovasculares. Com sua alta eficiência, reprodutibilidade e ampla aplicabilidade, essa abordagem não apenas fornece uma ferramenta importante para explorar o mecanismo das VEs da microbiota intestinal na hipertensão induzida por sal, mas também estabelece a base teórica para o desenvolvimento de estratégias de intervenção em doenças baseadas em EVs. Por meio deste estudo, espera-se abrir novos caminhos para a prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares, como a hipertensão^{arterial sistêmica 27,28}.

Este estudo experimental em animais está em conformidade com as diretrizes éticas relevantes e os padrões internacionais. Os estudos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar de Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Chinesa de Chengdu (instituição: Universidade de Medicina Chinesa de Chengdu; número do protocolo: 2018-21).

1. Preparação animal e regime alimentar

1. Aclimatar ratos Dahl machos sensíveis ao sal com 6 semanas de idade, peso corporal 180-200 g, criando a 50% ± 10% de umidade; Ciclo de luz de 12 h / 12 h; 20,0 ± 2,0 °C por 1 semana em condições específicas livres de patógenos.
2. Posteriormente, dividir os ratos igualmente em dois grupos (n = 6). Fornecer a cada grupo uma dieta diferente com duração de 6 semanas: uma dieta normal de sal (NSD) com cloreto de sódio a 0,5% e uma HSD com cloreto de sódio a 8%, que é comumente usada em estudos publicados 29,30,31. Os ratos tiveram acesso ilimitado a comida e água durante todo o estudo.

2. Monitoramento da pressão arterial

NOTA: A pletismografia do manguito da cauda foi usada como um método não invasivo para medição da pressão arterial, e o registro da pressão volumétrica (VPR) foi usado quando a pressão arterial foi medida a partir do volume sanguíneo da cauda.

1. Colocar os ratos individualmente em pequenas gaiolas com serradura, aquecidas durante 10 minutos a cerca de 37 °C e colocar numa contenção personalizada para roedores com nariz e porta ajustáveis para a entrada dos animais. Coloque os ratos em uma almofada de aquecimento em decúbito ventral para manter a temperatura corporal em 37 °C.
2. Conecte o sensor VPR na parte inferior da cauda e defina pelo menos 10 ciclos de adaptação para estabilizar o BP²⁸.
   1. Encha o manguito inflável na raiz da cauda e coloque o sensor pletismográfico (ou sensor fotoelétrico) abaixo. Encha lentamente acima da pressão sistólica (geralmente 200 mmHg) e, em seguida, solte lentamente. O instrumento detecta automaticamente o valor da pressão do desaparecimento da onda de pulso (pressão arterial sistólica) e recuperação (pressão arterial diastólica). Meça 3-5 vezes consecutivas e pegue o valor médio.
3. Treine todos os ratos para acomodar o procedimento de contenção e realize este estudo em um laboratório silencioso por volta das 9h para minimizar os efeitos da variação circadiana.
4. Meça a pressão arterial sistólica (PAS) e a pressão arterial diastólica (PAD) em dias alternados antes do sacrifício. Estimar a pressão arterial média (PAM) a partir da PAS e PAD
   PAM = (PAS + 2 PAD)/3

3. Extração de EVs

1. Coleta de amostras
   1. Mergulhe um cotonete estéril em álcool 75% e use-o para estimular o ânus do rato. A estimulação tinha como objetivo promover o peristaltismo intestinal e relaxar o esfíncter anal, promovendo assim a defecação. Depois que as fezes forem expelidas, colete-as usando uma pinça estéril em recipientes estéreis de tamanho apropriado e armazene-as imediatamente a -80 °C.
2. Preparação da amostra
   1. Usando uma colher, transfira 5 g de fezes para um tubo de centrífuga pré-pesado de 50 mL. Adicione 50 mL de PBS livre de endotoxinas a 37 °C pré-aquecido (concentração máxima de amostra de 10%) ao tubo e gire por 30 min. Arrefecer a centrífuga de alta velocidade a 4 °C.
   2. Centrifugue a 8.000 x g por 15 min após colocar as amostras simetricamente para permitir que a centrífuga se equilibre. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo de centrifugação estéril.
   3. Centrifugue novamente a 8.000 x g por 15 min. Aspirar o sobrenadante e utilizá-lo para uma análise mais aprofundada.
3. Preparação de extrato bruto
   1. Use uma unidade de filtro estéril de 0,22 μm. Coloque a unidade de filtro no gelo e segure a bomba de vácuo com firmeza. Transferir o sobrenadante obtido para a parte superior do filtro. Ligue a bomba de vácuo para coletar as amostras filtradas.
   2. Transferir o filtrado para um filtro centrífugo (10 kDa, 15 ml), centrifugar a 4 °C, 3.000 x g durante 30 min e concentrar a amostra a pelo menos 1400 μl.
   3. Coletar a amostra concentrada e, se necessário, diluí-la a 1400 μL usando PBS livre de endotoxinas pré-resfriado. Manter a amostra congelada imediatamente após a diluição.
      NOTA: O extracto bruto pode ser utilizado imediatamente ou conservado a -80 °C durante vários meses.
4. Separação de EVs
   1. Prepare o buffer de gradiente A e o buffer de gradiente B conforme descrito abaixo. Prepare o tampão com um dia de antecedência, pois leva várias horas para o composto se dissolver completamente. O tampão preparado pode ser armazenado a 4 °C durante 6 meses.
      1. Preparação do tampão gradiente A: Dissolva 0,25 M de sacarose, 6 mM de EDTA e 60 mM de Tris em 800 mL de água livre de endotoxinas por agitação do misturador magnético, com o pH ajustado para 7,4 usando ácido clorídrico. Diluir para 1 L com água sem endotoxinas. Use um filtro de topo de garrafa de 0.22 μm para filtrar o tampão.
      2. Preparação do tampão gradiente B: Dissolva 0,25 M de sacarose, 1 mM de EDTA e 10 mM de Tris em 800 mL de água livre de endotoxinas por agitação do misturador magnético, com pH ajustado para 7,4 com ácido clorídrico. Diluído a 1 L com água livre de endotoxinas. Use um filtro superior de garrafa de 0.22 μm para filtrar o tampão.
   2. Misture 1 volume de tampão de gradiente A e 5 volumes de meio de gradiente de densidade (o meio é solução de iodixanol a 60%) para preparar a solução de trabalho.
   3. Preparação da solução de iodixanol (10%, 20%, 40%): Para preparar uma solução de iodixanol a 10%, misture 1 unidade de solução de trabalho e 4 unidades de tampão B; para solução de iodixanol a 20%, misture 2 unidades de solução de trabalho e 3 unidades de tampão B; para solução de iodixanol a 40%, misture 4 unidades de solução de trabalho e 1 unidade de tampão B. Prepare cada solução fresca e guarde no gelo.
      NOTA: Novas soluções de trabalho devem ser preparadas para cada experimento, e um volume adicional de 10% de soluções pode ser preparado para contabilizar o erro experimental.
   4. Misture a solução preparada na etapa 3.3.3 com 7 mL de meio de gradiente de densidade para fazer uma solução de iodixanol a 50%.
   5. Para preparar um gradiente de densidade, adicione solução de azul de tripano à solução a 40% e à solução de iodixanol a 10% (peso / volume) para fornecer um contorno claro entre as camadas distintas.
   6. Transfira 8 mL de solução de iodixanol a 50% para o fundo do tubo de centrífuga de polipropileno de parede fina. Incline o tubo a 70° e transfira 8 mL de solução de iodixanol a 40% para a superfície do líquido. Adicione 8 mL de solução de iodixanol a 20%, depois 7 mL de solução de iodixanol a 10% e, finalmente, 2 mL de PBS livre de endotoxina.
      NOTA: Preparar um gradiente de densidade requer prática. A qualidade do gradiente de densidade tem um grande impacto nos resultados experimentais. Não coloque o tubo na vertical entre as diferentes etapas do processo de adição, pois isso afeta negativamente a qualidade do gradiente de densidade.
   7. Pré-resfrie a centrífuga com antecedência e coloque o gradiente de densidade preparado na ultracentrífuga. Parâmetros de entrada para iniciar, valores dos parâmetros: 100.000 x g, 20 h, 10 °C.
   8. Para separação manual da densidade do gradiente, retire lentamente 2 mL da solução do centro da superfície do sistema contendo um total de 34 mL de líquido. Cada 2mL é um gradiente, dividindo assim a solução de gradiente de densidade em 17 gradientes.
   9. Transferir as fracções de densidade para um tubo de amostra estéril utilizando uma pipeta e colocá-las imediatamente sobre gelo. Prenda o tubo da centrífuga entre o polegar e o indicador para garantir que ele permaneça na posição vertical.
5. Recuperação de EVs
   1. Usando um sistema de extração de EVs totalmente automatizado que aplica oscilação de pressão negativa por meio de um sistema de oscilação ultrassônica de acoplamento duplo no chip de ultrafiltração, remova as impurezas de ácidos nucléicos e proteínas da amostra através dos nanoporos e intercepte EVs, levando ao enriquecimento e purificação de EVs.
      1. Remova o filtrado na etapa 3.4.7 e adicione-o ao chip de ultrafiltração.
      2. Operar o instrumento de acordo com as instruções do instrumento e recolher o filtrado filtrado, ou seja, a solução enriquecida com exossomas. O processo principal é mostrado na Figura 1.

4. Identificação de EVs

1. Detecção de tamanho de partícula e concentração
   1. Avalie a distribuição de tamanho e o potencial zeta usando um contador de nanocoulômetro baseado em sensor de pulso resistivo (RPS). Selecione chips de nanoporos com uma faixa de medição de 60-200 nm para este experimento. Além disso, avalie a distribuição do tamanho das partículas e o potencial zeta dos EVs usando um contador de nanobiblioteca.
      1. Pegue uma quantidade adequada de solução de EVs e dilua-a em (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000).
      2. Diferentes diluições de soluções de EVs foram colocadas no instrumento para teste.
      3. O múltiplo de diluição com melhor estabilidade foi selecionado e testado novamente para obter dados mais precisos.
2. Ensaio LPS e BCA
   1. Ensaio de BCA: Lise EVs usando tampão RIPA e depois separe as proteínas. Determine o teor de proteína dos EVs usando o kit de determinação da concentração de proteína BCA.
   2. Ensaio LPS: Usando o kit de detecção de endotoxinas, adicione amostras, um detector de endotoxinas e cromogênico de acordo com as etapas do kit. Medir a absorvância a 545 nm e calcular a expressão LPS das vesículas externas de acordo com a curva-padrão.
3. Avaliação TEM: Para coloração negativa e análise TEM, aplique amostras em uma grade de cobre luminescente revestida com filme de carbono contínuo e manche com formato de uranila a 0,75%. Para crio-EM, absorva os EVs em uma grade de carbono EM de 300 malhas com uma superfície hidrofílica e congele em nitrogênio líquido. Observe e analise as grades usando o Cryo-TEM e registre as imagens em 22.000 ampliações³².
4. Caracterização de proteínas: Lise EVs usando tampão RIPA e depois separe as proteínas. Determine a concentração de proteína usando o kit de ensaio de proteína BCA, separe quantidades iguais de proteína de cada amostra por SDS-PAGE e coe com solução de corante azul de Coomassie após eletroforese para visualizar os perfis de proteína^33,34.
5. Sequenciamento e análise S: Extraia o DNA genômico das amostras fecais usando um kit de extração de DNA fecal. Avaliar a integridade e a concentração do ADN por electroforese em gel de agarose e espectrofotómetro. Amplificar a região V3 - V4 do gene 16S rRNA com primers universais, purificar os produtos de PCR, quantificá-los e sequenciá-los na plataforma Illumina. Realize a análise de dados usando o pipeline QIIME2³⁵.
   1. Classifique as variantes de sequência de amplicon (ASVs) usando DADA2 e compare com o banco de dados Silva usando o algoritmo VSEARCH. Use a análise de α-Diversidade para avaliar a riqueza e diversidade de espécies dentro das amostras, principalmente usando índices como o índice de Shannon e o índice de Chao1. β-A análise de diversidade compara a composição da comunidade microbiana entre as amostras e geralmente é visualizada pela análise de coordenadas principais (PCoA). Use métodos de análise diferencial, como tamanho de efeito de análise discriminante linear (LEfSe) e análise de gráfico de vulcão, para identificar táxons microbianos com condições significativamente diferentes ou entre grupos.

As concentrações de EVs foram determinadas em diferentes frações (Figura 2A). Os resultados experimentais mostraram que a concentração dos EVs exibiu um padrão típico de distribuição normal em uma série de soluções de gradiente de densidade (Figura 2B). Especificamente, na fração 9, a concentração de EVs atingiu seu ponto mais alto (3,85 x 10⁹), sugerindo que a principal fração de distribuição de EVs pode ser 9³⁶.

Para a determinação do teor de proteína, foram utilizados kits de BCA para avaliar o teor de proteína em diferentes frações (Figura 2C). Nesse método, o teor de proteína na fração 9 foi de 0,417 μg/μL, o que demonstra ainda mais a distribuição das EVs. Como o LPS é um componente único das bactérias Gram-negativas^37,38, kits de detecção de endotoxinas também foram usados para determinar a expressão de LPS (Figura 2D), a fim de avaliar a distribuição de EVs em diferentes frações. Os resultados experimentais mostraram que nas frações 9 e 10, a expressão de LPS foi significativamente maior do que nas demais frações (absorbância para a fração 9 = 0,8086, para a fração 10 = 0,8515), e sua distribuição apresentou distribuição normal, o que comprovou que as EVs estão distribuídas principalmente na fração 9. Quantidades relativamente maiores de proteína na fração 9 também foram observadas na eletroforese em gel SDS-PAGE de EVs isoladas de diferentes frações (Figura 2E).

Este estudo examinou EVs usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM; Figura 2F). Por meio de imagens de alta resolução por TEM, foi capaz de visualizar claramente a estrutura morfológica dos EVs, apresentando estruturas circulares semelhantes a membranas, o que é crucial para a compreensão da biologia dos EVs.

As alterações da pressão arterial foram determinadas nos grupos NSD e HSD após 2 meses de criação no NSD e HSD dos ratos. Podemos observar que a PAS (Figura 3A), a PAD (Figura 3B) e a PAM (Figura 3C) estavam significativamente aumentadas no grupo HSD, indicando que o modelo de hipertensão deste estudo foi construído com sucesso.

Neste estudo, a concentração de EVs foi detectada em diferentes grupos (Figura 3D), e os resultados mostraram que a concentração de EVs no grupo HSD foi significativamente maior do que a de ratos no grupo NSD. Isso sugere que o HSD afeta o nível de EVs, potencialmente devido a mudanças na composição da microbiota intestinal da qual os EVs se originam.

O tamanho das partículas dos EVs foi então medido neste estudo. Os resultados da medição indicam que o tamanho das partículas dos EVs é predominantemente em torno de 60 nm (Figura 3E), e o tamanho das partículas do grupo HSD é ligeiramente menor do que o do grupo NSD. Os dados medidos fornecem informações importantes para avaliar a distribuição de tamanho e homogeneidade dos EVs, facilitando o projeto experimental subsequente e o desenvolvimento de aplicações.

Em seguida, neste estudo, foi examinada a quantidade de expressão de LPS de EVs no grupo HSD e no grupo NSD (Figura 3F). Os resultados mostraram que a expressão de LPS por EVs no grupo HSD também foi significativamente maior do que no grupo NSD. Isso pode ser devido ao aumento de bactérias Gram-negativas na microbiota intestinal derivada da exovesícula ou pela maior concentração de EVs no grupo HSD do que no grupo NSD.

Para apoiar ainda mais as diferenças entre EVs nos grupos HSD e NSD, este estudo investigou a microbiota intestinal derivada e conduziu o sequenciamento de rRNA 16S de amostras de EVs dos grupos NSD e HSD para esclarecer ainda mais o efeito do HSD em EVs na microbiota intestinal em camundongos.

α-A análise da diversidade mostrou que a diversidade da microbiota intestinal foi significativamente reduzida no grupo HSD, com os índices de Shannon e ACE diminuindo (Figura 4A). β - A análise da diversidade, baseada na PCoA (Figura 4B), distinguiu os fenótipos microbianos entre os grupos no nível da ASV. A intervenção com alto teor de sal reverteu parcialmente as alterações fenotípicas na microflora intestinal e encontrou diferenças significativas na composição da microbiota intestinal derivada da vesícula externa entre os grupos (p = 0,001).

Depois de filtrar bactérias de baixa abundância e padronizar os dados, a anotação taxonômica identificou diferentes faixas de comunidades microbianas nas amostras. A microbiota intestinal derivada da exovesícula consistia principalmente de Proteobacteria (93,19%), Firmicutes (4,57%) e Bacteroidota (1,19%; Figura 4C). O grupo HSD aumentou significativamente a abundância de vesículas externas de Firmicutes (Figura 4D). No nível do gênero, os resultados mostraram que gêneros como Nevskia e Acinetobacter foram mais abundantes no grupo NSD, enquanto Delftia, Burkholderia_Ca e Clostridium_sen foram mais abundantes no grupo HSD (Figura 4E). Além disso, este estudo também usou mapas de calor para mostrar as diferenças nos EVs da microbiota intestinal entre o grupo HSD e o grupo NSD (Figura 4F). Após a intervenção com alto teor de sal, a abundância de algumas bactérias, Delftia e Burkholderia_Ca, aumentou significativamente, e Nevskia e Acinetobacter diminuíram significativamente (Figura 4G). Em conclusão, a intervenção com alto teor de sal alterou significativamente a diferença na produção de EVs derivadas da microflora intestinal, principalmente porque alterou a distribuição de suas bactérias parentais, e as principais características foram diminuições na diversidade, mudanças na estrutura de equilíbrio e mudanças na abundância de diferentes bactérias.

Figura 1: Extração e caracterização de vesículas externas derivadas de micróbios intestinais. (A) Fluxograma de extração de vesículas externas. (B) Caracterização das vesículas externas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Caracterização básica das EVs e análise do gradiente de densidade local. (A) Medições de concentração extravesícula e tamanho de partícula com diferentes gradientes de densidade (nm; partículas/mL). (B) Comparação das concentrações de vesículas externas da solução por gradiente de densidade 3 - 16 (partículas/mL). (C) Determinação do teor de proteína da solução no gradiente de densidade 6-12 pelo kit BCA (μg/mL). (D) Medição da expressão de LPS da solução por gradiente de densidade 7-11 com um kit de detecção de endotoxina (Abs). (E) Soluções com gradiente de densidade de 6 - 12 foram submetidas à eletroforese em gel SDS-PAGE e coradas com azul brilhante de Coomassie. (F) TEM: A barra de escala é de 100 nm; vesículas individuais são mostradas na imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise das alterações na pressão arterial e EVs sob diferentes dietas. (A) SBP; (B) DBP; (C) MBP; (D) Comparação das concentrações de vesículas externas nos grupos HSD e NSD; (E) Comparação do tamanho da vesícula externa nos grupos HSD e NSD. (F) LPS nas amostras NSD e HSD determinadas por espectrofotometria. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e NS significa sem significância, teste t. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise do teste de rRNA 16s sob as diferentes dietas. (A) A análise da α-diversidade; (B) Análise de coordenadas principais; (C) a abundância de microbiota intestinal no nível dos filos; (D) Mudanças nas bactérias em nível de filo; (E) Resultado LEfSe; (F) a análise do mapa de calor do cluster com base em gêneros bacterianos diferenciais; (G) Mudanças nas bactérias em nível de gênero. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e NS significa sem significância, teste t. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Neste estudo, nos concentramos nos EVs da microbiota intestinal em ratos sensíveis ao sal em um HSD e alcançamos uma série de conquistas importantes. Primeiro, um método de extração eficiente baseado na centrifugação de gradiente de densidade foi construído com sucesso para isolar EVs da microbiota intestinal de ratos sensível ao sal em HSD, e a maioria dos componentes não EV foram isolados por meio de um processo meticuloso e padronizado de manipulação experimental em animais e processamento de amostras. O método de extração de EVs de centrifugação com gradiente de densidade é altamente eficiente e reprodutível, melhor do que o método convencional de ultracentrifugação, e pode reter melhor a integridade e funcionalidade dos EVs, garantindo a qualidade da amostra e a viabilidade do estudo.

Em segundo lugar, os EVs foram identificados de forma abrangente por meio de várias tecnologias dinâmicas: a detecção de tamanho e concentração de partículas indica que os EVs têm uma distribuição de tamanho específica; As medições de LPS e BCA quantificam o conteúdo de proteína e a expressão de LPS de EVs; O TEM mostra claramente a estrutura morfológica dos EVs; e as características da proteína definem o espectro da proteína. Esses resultados de identificação revelam de forma abrangente as propriedades físicas e bioquímicas dos EVs, fornecendo suporte de dados confiável para estudos subsequentes.

Além disso, a tecnologia de sequenciamento do gene 16S rRNA usando análise aprofundada das diferenças entre a origem e a composição de EVs normais e HSD, e análise de diversidade α e análise de diversidade β mostraram que a alta ingestão de sal afeta significativamente as características genéticas dos EVs microbianos intestinais, incluindo estrutura da comunidade microbiana, riqueza de espécies e diversidade, para resolver de forma mais abrangente os efeitos da dieta rica em sal nos EVs da microbiota intestinal, fornece vários níveis de evidência para estudos mecanicistas.

Embora este método tenha algumas vantagens sobre o método convencional de centrifugação em excesso de velocidade em termos de recuperação e integridade de exossomos, ainda existem algumas limitações, como alta demanda de amostras e dificuldade em distinguir o hospedeiro da fonte de microflora. No entanto, em comparação com os métodos existentes, a centrifugação por gradiente de densidade tem vantagens únicas na manutenção da integridade funcional dos exossomos, o que fornece suporte técnico confiável para uma investigação mais aprofundada sobre o mecanismo pelo qual uma dieta rica em sal afeta a pressão arterial do hospedeiro através da flora intestinal. Além disso, para a estratificação de gradiente pouco clara encontrada durante o experimento, também melhoramos estendendo o tempo de centrifugação ou substituindo o rotor de alto desempenho.

No futuro, podemos explorar ainda mais o mecanismo das VE da microbiota intestinal na hipertensão induzida por uma dieta rica em sal, especialmente sua interação com o sistema imunológico, como células T pró-inflamatórias^39,40; ou usar produtos derivados de plantas para intervir nos EVs da microbiota intestinal^41,42, intervir ainda mais em doenças e explorar seu papel na regulação do metabolismo do hospedeiro e da resposta imune.

Em conclusão, este estudo não só fornece uma ferramenta importante para explorar o mecanismo de hipertensão induzida pelo sal da microbiota intestinal, através do modelo de rato sensível ao sal, aprofundar a compreensão da relação entre HSD, microbiota intestinal e EVs, e também abriu um novo caminho para a prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares como a hipertensão, fornece uma perspectiva única para o estudo da interação dieta-micróbio-hospedeiro.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82205240), pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Sichuan (2025ZNSFSC1836) e pelo Projeto Básico Clínico do Hospital Ortopédico Provincial de Sichuan (PY202414).