Separazione e caratterizzazione differenziale delle vescicole extracellulari microbiche intestinali in ratti sensibili al sale in condizioni di dieta ad alto contenuto di sale

Il protocollo descrive l'isolamento di vescicole extracellulari microbiche intestinali da ratti sensibili al sale alimentati con HSD utilizzando la centrifugazione in gradiente di densità. Le vescicole extracellulari sono state caratterizzate mediante tracciamento di nanoparticelle, TEM, saggi LPS/BCA e sequenziamento di rRNA 16S per analizzare le dimensioni, la morfologia, la composizione e l'origine del microbiota.

Un'elevata assunzione di sale è un importante fattore di rischio per l'ipertensione e il suo meccanismo sottostante può essere strettamente legato alle vescicole extracellulari (EV) secrete dal microbiota intestinale. Queste vescicole extracellulari, prodotte dal microbiota intestinale, trasportano vari componenti bioattivi che possono svolgere un ruolo cruciale nello sviluppo dell'ipertensione indotta da una dieta ricca di sale (HSD). Per studiare questo meccanismo, abbiamo sviluppato un metodo di estrazione efficiente basato sulla centrifugazione in gradiente di densità per isolare le vescicole extracellulari dal microbiota intestinale di ratti sensibili al sale alimentati con un HSD. Attraverso l'analisi delle dimensioni delle particelle, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e il rilevamento dei lipopolisaccaridi (LPS), abbiamo identificato la distribuzione a gradiente delle vescicole extracellulari del microbiota intestinale e abbiamo ottenuto un'estrazione precisa. Inoltre, il sequenziamento genico dell'rRNA 16S è stato impiegato per analizzare l'origine e le differenze di composizione delle vescicole extracellulari tra i gruppi normali e HSD, rivelando l'impatto di un'elevata assunzione di sale sulle caratteristiche genetiche delle vescicole extracellulari del microbiota intestinale. Questo studio fornisce strumenti preziosi e approfondimenti scientifici sui meccanismi del microbiota intestinale alla base dell'ipertensione indotta da sali e offre nuove prospettive per la prevenzione e il trattamento delle malattie correlate.

Il microbiota intestinale, noto anche come microflora del microbiota intestinale o microecologia intestinale, è un complesso di decine di migliaia di microrganismi situati nel tratto gastrointestinale biologico e svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della salute umana¹. Negli ultimi anni, con ulteriori ricerche, è stato scoperto che il microbiota intestinale può produrre vescicole extracellulari (EV)². Le vescicole extracellulari sono piccole vescicole rilasciate dalle cellule, che trasportano varie molecole nella cellula, come proteine, acidi nucleici e lipidi ^3,4. Possono interagire con altri microbi⁵, cellule epiteliali intestinali e persino tessuti e organi distanti⁶, influenzando così la salute del corpo umano ^7,8. Esiste uno stretto legame tra le vescicole extracellulari prodotte da questi microbioti intestinali e la dieta⁹.

Le vescicole extracellulari prodotte dal microbiota intestinale possono essere agenti significativi attraverso i quali una dieta ricca di sale (HSD) influisce sulla salute del corpo. L'HSD non solo interrompe direttamente l'equilibrio del microbiota intestinale¹⁰, portando a una significativa riduzione del numero di batteri benefici (come il Lactobacillus)¹¹, ma promuove anche la proliferazione di batteri nocivi (come i Bacteroides, ecc.)¹². Questo squilibrio riduce la funzione della barriera intestinale e aumenta il rischio di infiammazione intestinale. Inoltre, un HSD influisce ulteriormente sull'equilibrio acido-base e sull'assorbimento dei nutrienti nell'intestino modificando le attività metaboliche¹³ del microbiota intestinale, come la riduzione della produzione di acidi grassi a catena corta^14,15 con molteplici funzioni fisiologiche.

Questi cambiamenti non solo hanno un impatto sulla salute intestinale, ma possono anche regolare indirettamente la produzione e il rilascio di vescicole extracellulari e alterare la composizione e la funzione delle vescicole extracellulari. L'ambiente ad alto contenuto di sale può influenzare le normali funzioni fisiologiche delle cellule intestinali, compreso il rilascio e il trasporto di vescicole extracellulari, disturbando così il ruolo delle vescicole extracellulari nella trasmissione delle informazioni intercellulari e nella regolazione immunitaria. Allo stesso tempo, l'infiammazione intestinale può promuovere una varietà di vescicole extracellulari con funzioni speciali¹⁶ e diffondersi a tutto il corpo attraverso l'asse intestino-organo e altri modi^17,18, che è strettamente correlato all'insorgenza e allo sviluppo di ipertensione^19,20, malattie cardiovascolari²¹ e cerebrovascolari^22,23, obesità^24,25, diabete²⁶ e altre malattie croniche.

Pertanto, l'obiettivo generale di questo studio era quello di sviluppare un metodo efficiente e affidabile per estrarre le vescicole extracellulari dal microbiota intestinale di ratti sensibili al sale alimentati con HSD e di studiare sistematicamente le loro proprietà fisiche, composizione e funzioni. A causa delle caratteristiche del significativo aumento della pressione sanguigna dopo una dieta ricca di sale, sono stati selezionati ratti sensibili al sale che hanno rivelato l'effetto dell'HSD sul microbiota intestinale EV costruendo un metodo di estrazione efficiente. Il metodo si basava sulla centrifugazione in gradiente di densità e combinava varie tecniche di identificazione dinamica come il rilevamento delle dimensioni delle particelle, la misurazione LPS/BCA, la microscopia elettronica a trasmissione e l'analisi proteomica. Il protocollo mira a rivelare gli effetti dell'HSD sul microbiota intestinale EV e i suoi meccanismi nelle malattie cardiovascolari. Con la sua elevata efficienza, riproducibilità e ampia applicabilità, questo approccio non solo fornisce uno strumento importante per esplorare il meccanismo delle vescicole extracellulari del microbiota intestinale nell'ipertensione indotta da sale, ma getta anche le basi teoriche per lo sviluppo di strategie di intervento sulla malattia basate sulle vescicole extracellulari. Attraverso questo studio, speriamo di aprire nuove strade per la prevenzione e il trattamento delle malattie cardiovascolari, come l'ipertensione^27,28.

Questo studio sperimentale sugli animali è conforme alle linee guida etiche pertinenti e agli standard internazionali. Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato per il benessere e l'etica degli animali da laboratorio dell'Università di Medicina Cinese di Chengdu (istituto: Università di Medicina Cinese di Chengdu; numero di protocollo: 2018-21).

1. Preparazione degli animali e regime dietetico

1. Acclimatare ratti maschi Dahl sensibili al sale di 6 settimane, peso corporeo 180-200 g, allevandoli al 50% ± al 10% di umidità; ciclo di luce 12 h / 12 h; 20,0 ± 2,0 °C per 1 settimana in condizioni specifiche prive di agenti patogeni.
2. Successivamente, dividere i ratti in parti uguali in due gruppi (n = 6). Fornire a ciascun gruppo una dieta diversa che duri 6 settimane: una dieta salina normale (NSD) con lo 0,5% di cloruro di sodio e una HSD con l'8% di cloruro di sodio, che è comunemente usata negli studi pubblicati 29,30,31. I topi hanno avuto accesso illimitato a cibo e acqua durante lo studio.

2. Monitoraggio della pressione arteriosa

NOTA: La pletismografia del bracciale della coda è stata utilizzata come metodo non invasivo per la misurazione della pressione sanguigna e la registrazione della pressione volumetrica (VPR) è stata utilizzata quando la pressione sanguigna è stata misurata dal volume del sangue della coda.

1. Metti i ratti singolarmente in piccole gabbie con segatura, riscaldati per 10 minuti a circa 37 °C e mettili in un sistema di ritenuta per roditori personalizzato con naso regolabile e porta per l'ingresso degli animali. Metti i ratti su un termoforo in posizione prona per mantenere la loro temperatura corporea a 37 °C.
2. Collegare il sensore VPR alla parte inferiore della coda e impostare almeno 10 cicli di adattamento per stabilizzare il BP²⁸.
   1. Riempi il bracciale gonfiabile sulla radice della coda e posiziona il sensore pletismografico (o sensore fotoelettrico) sotto. Gonfiare lentamente fino a superare la pressione sistolica (di solito 200 mmHg) e poi rilasciare lentamente. Lo strumento rileva automaticamente il valore della pressione della scomparsa dell'onda del polso (pressione arteriosa sistolica) e del recupero (pressione arteriosa diastolica). Misura 3-5 volte consecutive e prendi il valore medio.
3. Addestrare tutti i ratti ad adattarsi alla procedura di contenzione ed eseguire questo studio in un laboratorio tranquillo intorno alle 9 del mattino per ridurre al minimo gli effetti della variazione circadiana.
4. Misurare la pressione arteriosa sistolica (SBP) e la pressione arteriosa diastolica (DBP) a giorni alterni prima del sacrificio. Stima della pressione arteriosa media (MAP) da SBP e DBP
   MAPPA = (SBP + 2 DBP)/3

3. Estrazione di veicoli elettrici

1. Raccolta campioni
   1. Immergi un batuffolo di cotone sterile in alcol al 75% e usalo per stimolare l'ano del ratto. La stimolazione aveva lo scopo di favorire la peristalsi intestinale e rilassare lo sfintere anale, favorendo così la defecazione. Dopo che le feci sono state espulse, raccoglierle con una pinza sterile in contenitori sterili di dimensioni adeguate e conservarle immediatamente a -80 °C.
2. Preparazione del campione
   1. Usando un cucchiaio, trasferisci 5 g di feci in una provetta da centrifuga da 50 ml pre-pesata. Aggiungere 50 mL di PBS preriscaldato a 37 °C privo di endotossine (concentrazione massima del campione del 10%) nella provetta e ruotare per 30 minuti. Raffreddare la centrifuga ad alta velocità a 4 °C.
   2. Centrifugare a 8.000 x g per 15 minuti dopo aver posizionato i campioni simmetricamente per consentire alla centrifuga di equilibrarsi. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga sterile.
   3. Centrifugare nuovamente a 8.000 x g per 15 min. Aspirare il surnatante e utilizzarlo per ulteriori analisi.
3. Preparazione dell'estratto grezzo
   1. Utilizzare un'unità filtro sterile da 0,22 μm. Posizionare l'unità filtro sul ghiaccio e tenere saldamente la pompa del vuoto. Trasferire il surnatante ottenuto sulla parte superiore del filtro. Accendere la pompa a vuoto per raccogliere i campioni filtrati.
   2. Trasferire il filtrato in un filtro centrifugo (10 kDa, 15 mL), centrifugare a 4 °C, 3.000 x g per 30 minuti e concentrare il campione ad almeno 1400 μL.
   3. Raccogliere il campione concentrato e, se necessario, diluirlo a 1400 μl utilizzando PBS preraffreddato privo di endotossine. Conservare il campione in ghiaccio subito dopo la diluizione.
      NOTA: L'estratto grezzo può essere utilizzato immediatamente o conservato a -80 °C per diversi mesi.
4. Separazione delle vescicole extracellulari
   1. Preparare il buffer sfumatura A e il buffer sfumatura B come descritto di seguito. Preparare il tampone con un giorno di anticipo, poiché il composto impiega diverse ore per dissolversi completamente. Il tampone preparato può essere conservato a 4 °C per 6 mesi.
      1. Preparazione del tampone gradiente A: Sciogliere 0,25 M di saccarosio, 6 mM di EDTA e 60 mM di Tris in 800 mL di acqua priva di endotossine mediante agitazione magnetica, con il pH regolato a 7,4 utilizzando acido cloridrico. Diluire a 1 L con acqua priva di endotossine. Utilizzare un filtro per flaconi da 0,22 μm per filtrare il tampone.
      2. Preparazione del tampone gradiente B: Sciogliere 0,25 M di saccarosio, 1 mM di EDTA e 10 mM di Tris in 800 mL di acqua priva di endotossine mediante agitazione magnetica, con pH regolato a 7,4 con acido cloridrico. Diluito a 1 L con acqua priva di endotossine. Utilizzare un filtro per flaconi da 0,22 μm per filtrare il tampone.
   2. Mescolare 1 volume di tampone gradiente A e 5 volumi di terreno gradiente di densità (il mezzo è una soluzione di iodixanolo al 60%) per preparare la soluzione di lavoro.
   3. Preparazione della soluzione di iodixanolo (10%, 20%, 40%): per preparare una soluzione di iodixanolo al 10%, miscelare 1 unità di soluzione di lavoro e 4 unità di tampone B; per una soluzione di iodixanolo al 20%, miscelare 2 unità di soluzione di lavoro e 3 unità di tampone B; per una soluzione di iodixanolo al 40%, mescolare 4 unità di soluzione di lavoro e 1 unità di tampone B. Preparare ogni soluzione fresca e conservare in ghiaccio.
      NOTA: Per ogni esperimento devono essere preparate nuove soluzioni funzionanti e può essere preparato un ulteriore 10% di volume di soluzioni per tenere conto dell'errore sperimentale.
   4. Miscelare la soluzione preparata al punto 3.3.3 con 7 mL di terreno a gradiente di densità per ottenere una soluzione di iodixanolo al 50%.
   5. Per preparare un gradiente di densità, aggiungere la soluzione di blu di tripano alla soluzione al 40% e alla soluzione di iodixanolo al 10% (wt/vol) per fornire un contorno chiaro tra gli strati distinti.
   6. Trasferire 8 mL di soluzione di iodixanolo al 50% sul fondo della provetta da centrifuga in polipropilene a parete sottile. Inclinare la provetta a 70° e trasferire 8 mL di soluzione di iodixanolo al 40% sulla superficie del liquido. Aggiungere 8 mL di soluzione di iodixanolo al 20%, quindi 7 mL di soluzione di iodixanolo al 10% e infine 2 mL di PBS privo di endotossine.
      NOTA: La preparazione di un gradiente di densità richiede pratica. La qualità del gradiente di densità ha un grande impatto sui risultati sperimentali. Non posizionare il tubo in posizione verticale tra le diverse fasi del processo di aggiunta, poiché ciò influisce negativamente sulla qualità del gradiente di densità.
   7. Preraffreddare la centrifuga in anticipo e posizionare il gradiente di densità preparato nell'ultracentrifuga. Parametri di input per l'avvio, valori dei parametri: 100.000 x g, 20 h, 10 °C.
   8. Per la separazione manuale della densità del gradiente, prelevare lentamente 2 mL della soluzione dal centro della superficie del sistema contenente un totale di 34 mL di liquido. Ogni 2 ml è un gradiente, dividendo così la soluzione del gradiente di densità in 17 gradienti.
   9. Trasferire le frazioni di densità in una provetta sterile utilizzando una pipetta e posizionarle immediatamente sul ghiaccio. Clamp la provetta da centrifuga tra il pollice e l'indice per assicurarsi che rimanga in posizione verticale.
5. Recupero dei veicoli elettrici
   1. Utilizzando un sistema di estrazione delle vescicole extracellulari completamente automatizzato che applica l'oscillazione a pressione negativa attraverso un sistema di oscillazione ultrasonica a doppio accoppiamento sul chip di ultrafiltrazione, rimuovere le impurità dell'acido nucleico e delle proteine nel campione attraverso il nanoporo e intercettare le vescicole extracellulari, portando all'arricchimento e alla purificazione delle vescicole extracellulari.
      1. Rimuovere il filtrato al punto 3.4.7 e aggiungerlo al chip di ultrafiltrazione.
      2. Far funzionare lo strumento secondo le istruzioni dello strumento e raccogliere il filtrato filtrato, ovvero la soluzione arricchita con esosomi. Il processo principale è illustrato nella Figura 1.

4. Identificazione delle vescicole extracellulari

1. Rilevamento delle dimensioni e della concentrazione delle particelle
   1. Valutare la distribuzione dimensionale e il potenziale zeta utilizzando un contatore nanocoulometrico basato sul rilevamento di impulsi resistivi (RPS). Per questo esperimento selezionare chip nanopore con un intervallo di misurazione compreso tra 60 e 200 nm. Inoltre, valutare la distribuzione granulometrica e il potenziale zeta delle vescicole extracellulari utilizzando un contatore di nanolibrerie.
      1. Prelevare una quantità appropriata di soluzione di EVs e diluirla in (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000).
      2. Diverse diluizioni di soluzioni EV sono state posizionate sullo strumento per i test.
      3. Il multiplo di diluizione con una migliore stabilità è stato selezionato e testato nuovamente per ottenere dati più accurati.
2. Dosaggio LPS e BCA
   1. Dosaggio BCA: Lisi delle vescicole extracellulari utilizzando il tampone RIPA e quindi separare le proteine. Determinare il contenuto proteico delle EV utilizzando il kit per la determinazione della concentrazione proteica BCA.
   2. Saggio LPS: Utilizzando il kit di rilevamento delle endotossine, aggiungere campioni, un rilevatore di endotossine e cromogenico secondo i passaggi del kit. Misurare l'assorbanza a 545 nm e calcolare l'espressione LPS delle vescicole esterne secondo la curva standard.
3. Valutazione TEM: per la colorazione negativa e l'analisi TEM, applicare i campioni su una griglia di rame luminescente rivestita con un film di carbonio continuo e colorare con formiato di uranile allo 0,75%. Per la crio-EM, assorbire i veicoli elettrici in una griglia di carbonio EM da 300 mesh con una superficie idrofila e congelare in azoto liquido. Osserva e analizza le griglie utilizzando il Cryo-TEM e registra le immagini a 22.000 ingrandimenti³².
4. Caratterizzazione delle proteine: Lisi delle vescicole extracellulari utilizzando il tampone RIPA e quindi separare le proteine. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine BCA, separare quantità uguali di proteine da ciascun campione mediante SDS-PAGE e colorare con la soluzione di colorante blu Coomassie dopo l'elettroforesi per visualizzare i profili proteici^33,34.
5. Sequenziamento e analisi S: Estrarre il DNA genomico dai campioni fecali utilizzando un kit di estrazione del DNA fecale. Valutare l'integrità e la concentrazione del DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio e spettrofotometro. Amplificare la regione V3 - V4 del gene 16S rRNA con primer universali, purificare i prodotti della PCR, quantificarli e sequenziarli sulla piattaforma Illumina. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando la pipeline QIIME2³⁵.
   1. Classificare le varianti di sequenza di ampliconi (ASV) utilizzando DADA2 e confrontarle con il database Silva utilizzando l'algoritmo VSEARCH. Utilizza l'analisi della diversità α per valutare la ricchezza e la diversità delle specie all'interno dei campioni, utilizzando principalmente indici come l'indice di Shannon e l'indice Chao1. L'analisi della diversità β confronta la composizione della comunità microbica tra i campioni ed è solitamente visualizzata mediante analisi delle coordinate principali (PCoA). Utilizzare metodi di analisi differenziale, come l'analisi discriminante lineare delle dimensioni dell'effetto (LEfSe) e l'analisi del grafico del vulcano, per identificare i taxa microbici con condizioni significativamente diverse o tra i gruppi.

Le concentrazioni di EVs sono state determinate in diverse frazioni (Figura 2A). I risultati sperimentali hanno mostrato che la concentrazione delle EV mostrava un tipico pattern di distribuzione normale in una serie di soluzioni a gradiente di densità (Figura 2B). In particolare, nella frazione 9, la concentrazione di EV ha raggiunto il suo punto più alto (3,85 x 10⁹), suggerendo che la frazione di distribuzione principale dei EV potrebbe essere 9³⁶.

Per la determinazione del contenuto proteico, sono stati utilizzati kit BCA per valutare il contenuto proteico in diverse frazioni (Figura 2C). In questo metodo, il contenuto proteico nella frazione 9 era di 0,417 μg/μL, il che dimostra ulteriormente la distribuzione delle vescicole extracellulari. Poiché l'LPS è un componente unico dei batteri Gram-negativi^37,38, sono stati utilizzati anche kit di rilevamento delle endotossine per determinare l'espressione di LPS (Figura 2D) al fine di valutare la distribuzione delle vescicole extracellulari in diverse frazioni. I risultati sperimentali hanno mostrato che nelle frazioni 9 e 10, l'espressione di LPS era significativamente più alta rispetto alle altre frazioni (assorbanza per la frazione 9 = 0,8086, per la frazione 10 = 0,8515), e la sua distribuzione mostrava una distribuzione normale, che dimostrava che le EV sono distribuite principalmente nella frazione 9. Quantità relativamente maggiori di proteine nella frazione 9 sono state osservate anche nell'elettroforesi su gel SDS-PAGE di vescicole extracellulari isolate da frazioni diverse (Figura 2E).

Questo studio ha esaminato le vescicole extracellulari utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM; Figura 2F). Attraverso l'imaging ad alta risoluzione del TEM, è stato in grado di visualizzare chiaramente la struttura morfologica delle vescicole extracellulari, caratterizzata da strutture circolari simili a membrane, che è fondamentale per comprendere la biologia delle vescicole extracellulari.

Le variazioni della pressione sanguigna sono state determinate nei gruppi NSD e HSD dopo 2 mesi di allevamento nella NSD e HSD dei ratti. Possiamo vedere che la SBP (Figura 3A), la DBP (Figura 3B) e la MBP (Figura 3C) sono aumentate significativamente nel gruppo HSD, indicando che il modello di ipertensione di questo studio è stato costruito con successo.

In questo studio, la concentrazione di EV è stata rilevata in diversi gruppi (Figura 3D) e i risultati hanno mostrato che la concentrazione di EV nel gruppo HSD era significativamente più alta di quella dei ratti nel gruppo NSD. Ciò suggerisce che l'HSD influisce sul livello di EV, potenzialmente a causa di cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale da cui hanno origine le EV.

In questo studio è stata quindi misurata la dimensione delle particelle delle vescicole extracellulari. I risultati delle misurazioni indicano che la dimensione delle particelle delle EV è prevalentemente di circa 60 nm (Figura 3E) e la dimensione delle particelle del gruppo HSD è leggermente inferiore a quella del gruppo NSD. I dati misurati forniscono informazioni importanti per valutare la distribuzione dimensionale e l'omogeneità dei veicoli elettrici, facilitando la successiva progettazione sperimentale e lo sviluppo dell'applicazione.

Quindi, in questo studio, è stata esaminata la quantità di espressione LPS delle EV nel gruppo HSD e nel gruppo NSD (Figura 3F). I risultati hanno mostrato che anche l'espressione di LPS da parte delle EV nel gruppo HSD era significativamente più alta di quella nel gruppo NSD. Ciò può essere dovuto all'aumento dei batteri Gram-negativi nel microbiota intestinale derivato dall'esovescicola o alla maggiore concentrazione di vescicole extracellulari nel gruppo HSD rispetto al gruppo NSD.

Per supportare ulteriormente le differenze tra le vescicole extracellulari nei gruppi HSD e NSD, questo studio ha studiato il microbiota intestinale derivato e ha condotto il sequenziamento dell'rRNA 16S di campioni di vescicole extracellulari dai gruppi NSD e HSD per chiarire ulteriormente l'effetto dell'HSD sulle vescicole extracellulari nel microbiota intestinale nei topi.

L'analisi della diversità α ha mostrato che la diversità del microbiota intestinale era significativamente ridotta nel gruppo HSD, con una diminuzione sia dell'indice Shannon che dell'indice ACE (Figura 4A). β-L'analisi della diversità, basata su PCoA (Figura 4B), ha distinto i fenotipi microbici tra i gruppi a livello di ASV. L'intervento salino elevato ha parzialmente invertito i cambiamenti fenotipici nella microflora intestinale e ha riscontrato differenze significative nella composizione del microbiota intestinale derivato dalla vescicola esterna tra i gruppi (p = 0,001).

Dopo aver filtrato i batteri a bassa abbondanza e standardizzato i dati, l'annotazione tassonomica ha identificato diversi intervalli di comunità microbiche nei campioni. Il microbiota intestinale derivato dall'esovescicola era costituito principalmente da Proteobatteri (93,19%), Firmicutes (4,57%) e Bacteroidota (1,19%; Figura 4C). Il gruppo HSD ha aumentato significativamente l'abbondanza di vescicole esterne di Firmicutes (Figura 4D). A livello di genere, i risultati hanno mostrato che generi come Nevskia e Acinetobacter erano più abbondanti nel gruppo NSD, mentre Delftia, Burkholderia_Ca e Clostridium_sen erano più abbondanti nel gruppo HSD (Figura 4E). Inoltre, questo studio ha anche utilizzato mappe di calore per mostrare le differenze nelle EV del microbiota intestinale tra il gruppo HSD e il gruppo NSD (Figura 4F). Dopo l'intervento ad alto contenuto di sale, l'abbondanza di alcuni batteri, Delftia e Burkholderia_Ca, è aumentata in modo significativo e Nevskia e Acinetobacter sono diminuiti significativamente (Figura 4G). In conclusione, l'intervento ad alto contenuto di sale ha modificato significativamente la differenza nella produzione di EV derivate dalla microflora intestinale, principalmente perché ha modificato la distribuzione dei loro batteri parentali, e le caratteristiche principali sono state diminuzioni della diversità, cambiamenti nella struttura dell'equilibrio e cambiamenti nell'abbondanza di batteri diversi.

Figura 1: Estrazione e caratterizzazione di vescicole esterne di derivazione microbica intestinale. (A) Diagramma di flusso dell'estrazione delle vescicole esterne. (B) Caratterizzazione delle vescicole esterne. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Caratterizzazione di base delle vescicole extracellulari e analisi del gradiente di densità locale. (A) Misure di concentrazione extra-vescicola e dimensione delle particelle con diversi gradienti di densità (nm; particelle/mL). (B) Confronto delle concentrazioni delle vescicole esterne in soluzione mediante gradiente di densità 3 - 16 (particelle/mL). (C) Determinazione del contenuto proteico in soluzione sul gradiente di densità 6-12 mediante il kit BCA (μg/mL). (D) Misurazione dell'espressione di LPS in soluzione mediante gradiente di densità 7-11 con un kit di rilevamento delle endotossine (Abs). (E) Le soluzioni con un gradiente di densità compreso tra 6 e 12 sono state sottoposte a elettroforesi su gel SDS-PAGE e colorate con blu brillante di Coomassie. (F) TEM: la barra della scala è di 100 nm; Le singole vescicole sono mostrate nell'immagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi delle variazioni della pressione sanguigna e delle vescicole extracellulari in diverse diete. (A) SBP; (B) DBP; (c) MBP; (D) Confronto delle concentrazioni di vescicole esterne nei gruppi HSD e NSD; (E) Confronto delle dimensioni delle vescicole esterne nei gruppi HSD e NSD. (F) LPS nei campioni NSD e HSD determinati mediante spettrofotometria. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e NS significa nessuna significatività, t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi del test dell'rRNA 16s nelle diverse diete. (A) L'analisi della diversità α; (B) Analisi delle coordinate principali; (C) l'abbondanza di microbiota intestinale a livello di phyla; (D) Cambiamenti nei batteri a livello di phylum; (E) Risultato LEfSe; (F) l'analisi della mappa di calore dei cluster basata su generi batterici differenziali; (G) Cambiamenti nei batteri a livello di genere. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e NS significa nessuna significatività, t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo studio, ci siamo concentrati sulle vescicole extracellulari del microbiota intestinale nei ratti sensibili al sale sottoposti a HSD e abbiamo raggiunto una serie di risultati chiave. In primo luogo, è stato costruito con successo un metodo di estrazione efficiente basato sulla centrifugazione in gradiente di densità per isolare le vescicole extracellulari dal microbiota intestinale di ratto sensibile al sale su HSD e la maggior parte dei componenti non EV sono stati isolati attraverso un meticoloso e standardizzato processo di manipolazione sperimentale animale e di elaborazione dei campioni. Il metodo di estrazione delle vescicole extracellulari della centrifugazione in gradiente di densità è altamente efficiente e riproducibile, migliore del metodo di ultracentrifugazione convenzionale, e può mantenere meglio l'integrità e la funzionalità delle vescicole extracellulari, garantendo la qualità del campione e la fattibilità dello studio.

In secondo luogo, le vescicole extracellulari sono state identificate in modo completo attraverso varie tecnologie dinamiche: il rilevamento delle dimensioni e della concentrazione delle particelle indica che le vescicole extracellulari hanno una distribuzione dimensionale specifica; Le misurazioni di LPS e BCA quantificano il contenuto proteico e l'espressione di LPS delle vescicole extracellulari; La TEM mostra chiaramente la struttura morfologica delle vescicole extracellulari; e le caratteristiche proteiche definiscono lo spettro proteico. Questi risultati di identificazione rivelano in modo completo le proprietà fisiche e biochimiche delle vescicole extracellulari, fornendo un supporto affidabile per gli studi successivi.

Inoltre, la tecnologia di sequenziamento del gene 16S rRNA che utilizza un'analisi approfondita delle differenze tra l'origine e la composizione delle vescicole extracellulari normali e HSD, e l'analisi della diversità α e l'analisi della diversità β hanno dimostrato che un'elevata assunzione di sale influisce in modo significativo sulle caratteristiche genetiche delle vescicole extracellulari microbiche intestinali, tra cui la struttura della comunità microbica, la ricchezza e la diversità delle specie, per risolvere in modo più completo gli effetti della dieta ricca di sale sulle vescicole extracellulari del microbiota intestinale. Fornisce molteplici livelli di evidenza per gli studi meccanicistici.

Sebbene questo metodo presenti alcuni vantaggi rispetto al metodo convenzionale di centrifugazione a velocità eccessiva in termini di recupero e integrità degli esosomi, ci sono ancora alcune limitazioni, come l'elevata richiesta di campioni e la difficoltà di distinguere l'ospite dalla fonte della microflora. Tuttavia, rispetto ai metodi esistenti, la centrifugazione in gradiente di densità presenta vantaggi unici nel mantenere l'integrità funzionale degli esosomi, fornendo un supporto tecnico affidabile per ulteriori indagini sul meccanismo con cui una dieta ricca di sale influisce sulla pressione sanguigna dell'ospite attraverso la flora intestinale. Inoltre, per la stratificazione del gradiente poco chiara riscontrata durante l'esperimento, abbiamo anche migliorato estendendo il tempo di centrifugazione o sostituendo il rotore più performante.

In futuro, potremo esplorare ulteriormente il meccanismo delle vescicole extracellulari del microbiota intestinale nell'ipertensione indotta da una dieta ricca di sale, in particolare la sua interazione con il sistema immunitario, come le cellule T pro-infiammatorie^39,40; o utilizzare prodotti di origine vegetale per intervenire nelle vescicole extracellulari del microbiota intestinale^41,42, intervenire ulteriormente nelle malattie ed esplorare il loro ruolo nella regolazione del metabolismo dell'ospite e della risposta immunitaria.

In conclusione, questo studio non solo fornisce uno strumento importante per esplorare il meccanismo dell'ipertensione indotta dal sale del microbiota intestinale, attraverso il modello di ratto sensibile al sale, approfondire la comprensione della relazione tra HSD, microbiota intestinale e vescicole extracellulari, ma ha anche aperto una nuova strada per la prevenzione e il trattamento di malattie cardiovascolari come l'ipertensione, ma fornisce una prospettiva unica per lo studio dell'interazione dieta-microbo-ospite.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82205240), dalla Natural Science Foundation della provincia del Sichuan (2025ZNSFSC1836) e dal Clinical Basic Project dell'Ospedale ortopedico provinciale del Sichuan (PY202414).