Адцептивная модель передачи ревматоидного артрита у мышей

В данной работе мы сообщаем о протоколе, устанавливающем мышиную модель ревматоидного артрита (РА) путем адоптивного переноса CD4⁺ Т-клеток от мышей SKG, обеспечивая быстрый и надежный экспериментальный инструмент для изучения иммунологических механизмов, патологического прогрессирования и разработки новых методов лечения РА.

Ревматоидный артрит (РА) — это хроническое системное аутоиммунное воспалительное заболевание, которое может привести к повреждению суставов, деформациям, инвалидности и даже смерти. Из-за сложной этиологии и гетерогенной клинической картины современные стратегии лечения остаются недостаточными для эффективного контроля прогрессирования заболевания, особенно для достижения ранней диагностики и предоставления персонализированной терапии. Поэтому разработка новых терапевтических подходов имеет решающее значение. Для достижения этой цели необходимы надежные животные модели для исследования патогенеза РА. В настоящее время используется несколько животных моделей РА, в том числе модель коллаген-индуцированного артрита (CIA), модель K/BxN и мышь SKG. Хотя эти модели могут успешно имитировать иммунные механизмы и клинические проявления РА, каждая из них имеет заметные ограничения.

В этом протоколе мы описываем процесс создания мышиной модели РА путем адоптивного переноса CD4⁺ Т-клеток от мышей SKG. По сравнению с обычными моделями, эта модель обеспечивает более короткое время укоренения и более высокий уровень заболеваемости (100%) у мышей C57BL/6. Он относительно экономически эффективен, включает в себя простые процедуры и надежно воспроизводит Т-клеточные иммунные реакции, обеспечивая превосходный экспериментальный контроль и воспроизводимость. Мы провели всестороннюю оценку модели, оценив клинический фенотип, такой как симптомы суставов. При клинической оценке фенотипа мы наблюдали значительный отек суставов и воспалительные реакции. Кроме того, используя технологию ПЦР для измерения уровней экспрессии ключевых факторов транскрипции, мы обнаружили, что эта модель эффективно моделирует иммунные реакции, опосредованные Т-клетками, и ключевые патологические особенности РА. С помощью этой модели исследователи могут лучше моделировать Т-клеточный иммунный ответ и ключевые патологические особенности РА, тем самым обеспечивая надежный и эффективный экспериментальный инструмент для изучения иммунных механизмов и патологического прогрессирования, а также разработки новых методов лечения РА.

РА является хроническим системным аутоиммунным воспалительным заболеванием, которое поражает примерно 1% населения мира, вызывая высокую заболеваемость и тяжелое социально-экономическое бремя ^1,2. Заболевание характеризуется стойким воспалением синовиальной оболочки, разрушением хряща и эрозией костей, что в конечном итоге приводит к деформации суставов, инвалидности и, в тяжелых случаях, к преждевременной смерти ^3,4,5. Патогенез РА включает в себя взаимодействие генетических, экологических и иммунных факторов, ключевыми особенностями которых являются аномальная активация клеточного иммунитета, чрезмерное высвобождение провоспалительных цитокинов и нарушение иммунной толерантности ^6,7. В этом процессе аутореактивные Т-клетки, в частности CD4⁺ Т-клетки, как ключевые движущие силы иммунной регуляции, напрямую способствуют патологическому прогрессированию РА через несколько механизмов.

Т-хелперные клетки (Th)1 продуцируют интерферон-гамма (ИФН-γ), который активирует макрофаги и синовиальные фибробласты, что приводит к высвобождению фактора некроза опухоли (TNF)-α и интерлейкина (IL)-6 и вызывает синовит. Клетки Th17 секретируют IL-17, который способствует активации синовиальных клеток и остеокластов, усугубляя разрушение хряща и эрозию костей ^8,9. Кроме того, CD4⁺ Т-клетки усиливают воспалительные реакции, активируя В-клетки с помощью костимулирующих сигналов, индуцируя выработку антител к цитруллинированным белкам (ACPA) и ревматоидных факторов (RF)¹⁰. Между тем, дефекты функции и снижение количества Treg-клеток являются ключевыми причинами иммунного дисбаланса при РА, что приводит к неконтролируемому воспалению^11,12. Из-за сложной этиологии и гетерогенной клинической картины ранняя диагностика затруднена, а современное лечение РА неудовлетворительно. Поэтому разработка новых терапевтических подходов имеет решающее значение. Надежные животные модели имеют решающее значение для изучения патогенеза РА, чтобы получить более глубокое понимание потенциальных механизмов РА и изучить новые стратегии лечения.

Традиционные модели РА, такие как модели ЦРУ и мышей K/BxN 13,14,15, способствуют улучшению нашего понимания РА. Однако эти модели имеют существенные ограничения. Например, модель CIA на мышах C57BL/6 имеет низкий процент успеха и длительный период индукции, что снижает ее полезность в определенных экспериментальных условиях. Аналогичным образом, несмотря на то, что модель K/BxN является ценной, она является дорогостоящей в установлении и имеет ограничения в воспроизведении сложной патологии человеческого РА, в частности, взаимодействий между иммунными клетками и цитокинами.

Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали новую мышиную модель РА путем переноса CD4⁺ Т-клеток от мышей SKG с фоном C57BL/6 к иммунокомпетентным мышам C57BL/6 в сочетании с маннан-индуцированной иммунной активацией. Эта модель эффективно воспроизводит ключевые особенности РА, в том числе опосредованные Т-клетками иммунные реакции и основные патологические характеристики, такие как воспаление синовиальной оболочки и эрозия суставов, предлагая при этом преимущества в воспроизводимости, простоте и экономической эффективности. Мы подробно изложили методологию создания этой модели, которая включает в себя генерацию мышей SKG на фоне C57BL/6, выделение CD4⁺ Т-клеток из мышей SKG, их адоптивный перенос и последующую индукцию маннаном. Кроме того, мы описываем клинические и гистологические критерии, используемые для оценки тяжести артрита, обеспечивая его надежность и воспроизводимость. Последовательно имитируя иммунные реакции, опосредованные Т-клетками, и фундаментальные патологические особенности РА, эта модель служит надежным и эффективным экспериментальным инструментом для изучения иммунных механизмов, прогрессирования заболевания и разработки новых методов лечения РА.

Все экспериментальные процедуры в этом исследовании строго соответствовали рекомендациям, изложенным в «Руководстве Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных», включая животноводство, экспериментальные операции и эвтаназию, и были одобрены Комитетом по этике животных Медицинского колледжа Тунцзи Хуачжунского университета науки и технологии.

1. Животные

1. Поколение мышей SKG (фон C57BL/6)
   1. Стратегия редактирования генов
      1. Разработать специфическую направляющую РНК (гРНК), нацеленную на ген ZAP70 (последовательность гРНК: 5'-CAGCCCACGAGCGAATGCCCTGG-3') и провести редактирование генов с помощью системы CRISPR/Cas9. Сконструируйте донорскую ДНК с мутацией ZAP70(W163C) для обеспечения точной инкорпорации-n мутации (здесь, CAGGCCCCACACAGGTGGAGAAGCTCATTG
         CTACCACAGCCCGAGCGAATGCCCТГ
         CTATCACAGCAGCCTGACTCGTGAGGAG
         GCCGAGCGCAAACTCTATTCCGGCCA).
         Примечание: ГРНК направляет белок Cas9 к определенному участку гена ZAP70 для точного разрезания. Подчеркнутое основание в последовательности донорской ДНК указывает на мутировавшие основания. Эта мутация соответствует мутации W163C (TGG→TGC) в белке ZAP70, который находится в критическом функциональном домене.
   2. Инъекция микрошприца
      1. Используйте микроинъекцию для введения мРНК, гРНК и донорской ДНК Cas9 в оплодотворенные яйцеклетки мыши C57BL/6. Совместно вводите белок Cas9 и гРНК, чтобы они расщепляли ген ZAP70 и вставляли мутацию ZAP70 (W163C) посредством гомологичной рекомбинации. Пересадите введенные оплодотворенные яйцеклетки псевдобеременным самкам мышей, подождите примерно 20 дней и определите родившихся мышей как поколение F0. Определите генотипы с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования (см. шаг 1.1.5.3).
   3. Генотипирование мышей поколения F0
      1. Проведите ПЦР и секвенирование на мышах поколения F0 для подтверждения приобретения мутации ZAP70 (W163C) (см. шаг 1.1.5.3).
         Примечание: Мыши поколения F0 являются химерными из-за быстрого расщепления эмбриона. У них может отсутствовать стабильная генетическая передача. Внедряйте серийное разведение для создания стабильных линий.
   4. Сбор и генотипическая идентификация мышей поколения F1
      1. Скрещивание F0-положительных мышей с мышами дикого типа C57BL/6J для получения мышей поколения F1 и выполнение генотипирования с помощью ПЦР и секвенирования для получения мышей SKG (предыстория C57BL/6; см. шаг 1.1.5.4).
   5. Методы генотипирования на основе ПЦР для поколений F0 и F1
      1. Стерильными ножницами отрежьте кусок 0,5 см от хвоста.
      2. Извлеките ДНК мыши с помощью набора для экстракции геномной ДНК животных.
      3. Для F0 готовят следующую реакционную систему ПЦР: 13,2 мкл ddH₂O, 2 мкл ПЦР-буфера, 2 мкл 2,5 мМ dNTP, по 0,5 мкл каждого из прямых (5'-GATGCCTAGGTGGGGGGTTCC-3') и обратных (5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTCTACA-3') праймеров (10 пмоль/мкл), 0,8 мкл ДНК-полимеразы и 1 мкл геномной ДНК (50-100 нг/мкл), выделенных из хвостов мышей, для конечного объема реакции 20 μл. Провести амплификацию генов с помощью следующей программы ПЦР: 94 °C в течение 3 мин; 98 °C в течение 15 с, 58 °C в течение 15 с и 68 °C в течение 1 мин, в течение 35 циклов; 68 °C в течение 5 мин; держать при температуре 12 °C.
      4. Для F1 готовят следующую реакционную систему ПЦР: 14,9 мкл ddH₂O, 2 мкл 10x Taq ПЦР-буфера, 1 мкл 2,5 мМ dNTP, по 0,5 мкл каждого из прямых (5'-GATGCCTAGGTGGGGGGTTCC-3') и обратных (5'-ACTTGCCTACTACGCTACTGCTCTACA-3') праймеров (10 пмоль/мкл), 0,1 мкл Taq ДНК-полимеразы и 1 мкл геномной ДНК (50-100 нг/мкл), выделенных из хвостов мышей, для конечного объема реакции 20 μл. Проводят амплификацию генов с помощью следующей программы ПЦР: 94 °C в течение 5 мин; 94 °C в течение 30 с, 58 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 1 мин, повторяется в течение 35 циклов; 72 °C в течение 5 мин; держать при температуре 12 °C.
      5. Запустите электрофорез для подтверждения ожидаемого размера изделий.
      6. Секвенирование продуктов ПЦР для проверки как генотипа, так и конкретной мутации.
2. Подбор мышей-доноров и реципиентов
   1. Выберите мышей SKG в возрасте 6-8 недель (самцов или самок) в качестве донорских мышей.
   2. Выберите мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель (предпочтительно самку для получения стабильных экспериментальных результатов) в качестве мышей-реципиентов.
   3. Размещение мышей C57BL/6 и SKG (в возрасте 6-8 недель) в условиях SPF в индивидуально вентилируемых клетках. Обеспечьте свободный доступ к корму с SPF и стерильной воде в течение 12-часового цикла свет/темнота. Акклиматизируйте мышей за 1 неделю до начала экспериментов.

2. Выделение и очистка CD4⁺ Т-клеток у мышей SKG

1. Усыпьте мышей SKG под стерильным ламинарным колпаком с использованием асфиксии CO₂ . Погрузите мышей в 75% спирт на 5 минут для дезинфекции. Располагайте селезенку в брюшной полости, а также лимфатические узлы (паховые и подколенные) в паховой и подколенной областях. Осторожно рассеките селезенку и лимфатические узлы с помощью стерильных щипцов и ножниц и сразу же перенесите их на предварительно охлажденный PBS.
2. Поместите селезенку и лимфатические узлы в отдельные чашки Петри. Продавите ткани через клеточное сетчатое фильтр 70 мкм с помощью поршня стерильного шприца и постепенно добавляйте 10-12 мл предварительно охлажденного PBS для получения однородной клеточной суспензии. Пропустите клеточную суспензию через тот же клеточный фильтр 70 мкм в центрифужную пробирку объемом 15 мл, затем центрифугируйте при 300 × г в течение 7 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и сохраните клеточную гранулу.
3. Проведите окрашивание трипановым синим для оценки жизнеспособности клеток. Посчитайте клетки и убедитесь, что жизнеспособность составляет ≥90%.
4. Отрегулируйте концентрацию клеток до 1 ×^{10 8} клеток/мл с помощью буфера, входящего в комплект для выделения CD4⁺ Т-клеток.
5. Перелейте 100 мкл клеточной суспензии (10⁷ клеток) в новую пробирку. Добавьте 10 мкл биотина-антител-коктейля, тщательно перемешайте и выдерживайте на льду в течение 15 минут.
6. Подвешивайте бусины с помощью вихревых движений на максимальной скорости. Добавьте 10 μл суспензии стрептавидина в гранулах, хорошо перемешайте и выдерживайте на льду в течение 15 минут.
7. Добавьте 2,5 мл буфера, входящего в комплект для выделения CD4⁺ Т-клеток, и поместите пробирку в магнит на 5 минут.
8. Осторожно перелейте жидкость (целевые клетки) из пробирки в новую стерильную пробирку, затем центрифугируйте при 4 °C, 300 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и сохраните клеточную гранулу.
9. Добавьте достаточное количество стерильного раствора PBS для корректировки концентрации клеток до 2 × 10⁶ клеток/мл и оставьте суспензию на льду для последующего использования.
10. Используйте проточную цитометрию для оценки чистоты отсортированных клеток (дополнительный рисунок S1). Рассчитайте чистоту клеток следующим образом: (Количество CD4⁺ Т-клеток / Общее количество клеток) × 100%. Убедитесь, что чистота составляет ≥90%¹⁶.

3. Адоптивный перенос CD4⁺ Т-клеток

1. Обезболите мышей C57BL/6 2-3% изофлураном, достигнув глубины анестезии, при которой мыши теряют всякую подвижность, но сохраняют нормальное спонтанное дыхание.
2. Аккуратно очистите внутренний кантус (уголок глаза) мыши стерильным ватным тампоном, чтобы удалить выделения и волосы, обнажив вену.
3. Обездвижите мышь вручную. Наберите 200 мкл суспензии CD4⁺ Т-клеток (2 × 10,^5-5 × 10,⁵ клеток на мышь) в шприц объемом 1 мл. Введите иглу под углом 10-15° во внутреннюю кантальную вену, обеспечивая точное размещение. Медленно и равномерно вводите клеточную суспензию в течение 10-15 с.
4. После извлечения иглы аккуратно надавите на внутреннюю область кантала стерильным ватным тампоном в течение 3-5 с, чтобы предотвратить кровотечение.
5. Поместите мышь в тихую, сухую и чистую клетку для наблюдения до тех пор, пока она полностью не придет в сознание, со стабильным дыханием и без аномального поведения (например, подергивания или внезапной смерти). Переместите мышь в стандартный каркас после подтверждения стабильного послеоперационного состояния.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку внутренняя кантальная вена имеет небольшой размер, бережное обращение и контролируемая скорость инфузии имеют решающее значение для предотвращения разрыва вены или блокировки клеток, вызванной чрезмерной скоростью.
6. Запишите детали инфузии и пометьте мышей модельной и контрольной групп (по четыре животных в группе), чтобы избежать путаницы в последующих экспериментах. Вводите CD4⁺ Т-клетки для моделирования мышей и не лечите контрольных мышей. Убедитесь, что все мыши являются мышами-реципиентами.

4. Стимуляция и индукция маннана

1. Проводят индукцию маннаном на 4-е сутки (через 72 ч после инфузии CD4⁺ Т-клеток). Примените одни и те же условия индукции ко всем экспериментальным и контрольным мышам.
   1. Взвесьте порошок маннана и растворите его в стерильном PBS до концентрации 100 мг/мл.
   2. Держите мышь правильно, чтобы обнажить ее брюшную полость. Продезинфицируйте кожу 75% спиртом и определите место инъекции (~1 см в сторону от средней линии живота).
   3. Тщательно перемешайте раствор маннана и наберите соответствующий объем (20-30 мг на одну мышь) в шприц объемом 1 мл. Введите иглу под углом 45° в брюшную полость и медленно вводите раствор, чтобы обеспечить равномерное распределение. Медленно извлеките иглу и аккуратно прижмите место инъекции стерильным ватным тампоном в течение нескольких секунд, чтобы предотвратить протекание или инфицирование.
2. Поместите инъекционную мышь в тихую и чистую клетку и внимательно следите за ней в течение 5-10 минут, чтобы убедиться в отсутствии утечки в месте инъекции, вздутия живота или аномального дыхания.
3. Подробно запишите детали инъекции для каждой мыши.

5. Измерения

1. Наблюдение за клиническим фенотипом
   1. Оценка симптомов артрита
      1. Проводите совместную оценку каждые 3 дня после индукции маннана. Осмотрите все суставы передних и задних конечностей, уделяя особое внимание коленным, голеностопным, лучезапястным и пальцевым суставам. Оцените тяжесть артрита по стандартным критериям (Таблица 1)¹⁷. Записывайте и сравнивайте общие баллы в каждый момент времени, чтобы оценить прогрессирование артрита.
2. Регистрация патологических особенностей тканей
   1. После месяца индукции маннана усыпьте мышей под стерильным ламинарным капюшоном с использованием удушения CO₂ (в соответствии с рекомендациями этического комитета), закрепите мышь на поролоновой доске и обнажите задние конечности. Разрежьте кожу, начиная с лодыжки, и отклеивайте вверх, чтобы обнажить мышцы и суставы. Определите голеностопный сустав (между большеберцовой/малоберцовой и таранной костями) и плюснефаланговые суставы (между плюсневыми и проксимальными фалангами) и рассеките эти суставы для гистологического анализа и подготовки парафиновых срезов.
   2. Зафиксируйте иссеченные ткани в 4% формалине на 72 ч, затем перенесите их на 10% этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА, pH 7,4) на 4 недели декальцинации для обеспечения полной декальцинации.
   3. После декальцинации промойте ткани PBS, чтобы удалить остатки фиксатора, а затем обезвожьте ткани с помощью градуированного этанола (75%, 80%, 95%, 100%).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формалин может раздражать глаза, кожу и дыхательные пути. Его следует обрабатывать в вытяжном шкафу.
   4. Погрузите салфетку в парафин с помощью машины для заделки парафина. С помощью микротома разрежьте внедренную ткань на ломтики толщиной 4 мкм. Поместите секции в водяную баню с температурой 40 °C с дистиллированной водой.
   5. Перенесите и просушите срезы. Разместите секции на стеклянных предметных стеклах. Высушите их в течение ночи при комнатной температуре (RT). Храните предметные стекла в RT для окрашивания.
   6. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)
      1. Поместите горки в духовку при температуре 60 °C на 2 часа, чтобы удалить парафин.
      2. При комнатной температуре погрузите предметные стекла в следующей последовательности на 5 мин каждая: ксилол → ксилол → 100% этанол → 100% этанол → 95% этанол → 80% этанол → 75% этанол. Промыть в дистиллированной воде в течение 2 минут.
      3. Последовательно окрасьте предметные стекла в раствор гематоксилина в течение 5 минут, промойте в деионизированной воде в течение 2 минут, затем обработайте 0,1% нашатырным спиртом в течение 1 минуты, промойте в течение 3 x 2 минут в деионизированной воде, окрасьте эозином в течение 1 минуты и, наконец, промойте в деионизированной воде в течение 2 минут.
      4. Погрузите предметные стекла на 5 минут каждый в 80% этанол → 95% этанол → 100% этанол → ксилол → ксилол.
      5. Высушите слайды на воздухе естественным образом и закрепите с помощью нейтральной смолы.
   7. Safranin O-Fast Зеленое окрашивание
      1. Депарафинизируйте срезы парафина до состояния воды и покрасьте их с помощью набора для окрашивания Ван Гизона. После окрашивания смонтируйте предметные стекла с нейтральной смолой и сделайте снимки под микроскопом (подготовлено в шаге 5.2.5).
3. Изменения в Т-клетках и цитокинах
   1. Удалите селезенку из мыши с помощью стерильных хирургических инструментов.
      1. Извлеките общую РНК из ткани селезенки с помощью набора для экстракции РНК в соответствии с инструкциями производителя. Количественно оцените концентрацию и чистоту РНК с помощью спектрофотометра и убедитесь, что соотношение A260/A280 находится в диапазоне от 1,8 до 2,0.
      2. Синтезируйте кДНК из выделенной РНК с помощью набора для обратной транскрипции. Следуйте протоколу производителя для настройки реакции и условий цикла. Храните кДНК при температуре -20 °C для последующего количественного ПЦР-анализа.
      3. Проведение количественной ПЦР: Измерение относительных уровней экспрессии мРНК Tbx21, Gata3, Il-17 и Foxp3 в ткани селезенки измеряли с помощью количественной ПЦР на основе SYBR Green в реакциях объемом 10 мкл, содержащих: 5 мкл 2x мастер-смеси SYBR Green, по 0,2 мкл прямых и обратных праймеров (10 мкМ; последовательности в таблице 2), 0,5-1 мкл кДНК (50-100 нг/мкл), и вода без нуклеаз к объему. Используйте следующие условия термоциклирования: начальная денатурация при 95 °C в течение 30 с, затем 40 циклов при 95 °C в течение 10 с и 60 °C в течение 30 с, с анализом кривой расплава (65-95 °C). Нормализуйте уровни экспрессии до Gapdh с помощью метода 2^(-ΔΔCt).
   2. Выделение сыворотки крови и анализ цитометрической матрицы гранул (КБА)
      1. Соберите кровь у мыши с помощью орбитального забора крови методом энуклеации, переложите кровь в пробирку для сбора, покрытую антикоагулянтом, и дайте ей постоять при комнатной температуре в течение 30 минут. Свернувшуюся кровь центрифугировать при температуре 4 °C, 1 000 × г в течение 15 минут, тщательно собрать надосадочную жидкость (сыворотку) и хранить при температуре -80 °C до анализа.
      2. Определите уровни экспрессии IL-6, IL-10, IL-17, TNF-α и IFN-γ в сыворотке крови с помощью набора CBA в соответствии с инструкцией производителя.

Клиническая оценка отека суставов и частоты заболеваемости у мышей
На рисунке 1 показана клиническая оценка отека суставов и частота заболеваемости у модельных мышей. Результаты показывают, что у всех мышей в модельной группе развилось заболевание (n = 4), с частотой заболеваемости 100%. Баллы в модельной группе значительно выросли, показали кратковременное облегчение на второй неделе, а затем выросли в течение 6 недель.

Проявление отечности суставов у мышей
Суставы мышей модельной группы демонстрируют значительное утолщение и отек, при этом заметный отек и утолщение также наблюдаются в передних и задних конечностях (рис. 2).

Патологические результаты голеностопных суставов мышей
Патологические результаты показывают, что по сравнению с контрольной группой, мыши модельной группы демонстрируют значительное утолщение синовиальной оболочки в голеностопных суставах, разрыв в кости и выраженную агрегацию воспалительных клеток (рис. 3, рис. 4 и рис. 5).

Сывороточные Т-клеточные воспалительные факторы
По сравнению с контрольной группой, мыши модельной группы показали достоверное повышение сывороточных уровней IL-10 (7,51 против 2,15 пг/мл), TNF (78,83 против 13,11 пг/мл), IL-17 (101,6 против 12,64 пг/мл) и ИФН-γ (5,15 против 1,90 пг/мл) (p < 0,05). IL-6 также достоверно увеличился по сравнению с контрольной группой (15,59 против 6,27 пг/мл) (p = 0,05, рис. 6).

Изменения в подмножествах Т-клеток Th1/2/17 и Tregs в селезенке
Уровни экспрессии мРНК Tbx21 (Th1), Gata3 (Th2), Il-17 (Th17) и Foxp3 (Tregs) были измерены для оценки изменений в субпопуляциях Т-клеток в селезенке. Эти гены кодируют ключевые факторы транскрипции и цитокины, которые определяют дифференцировку и функцию соответствующих подмножеств Т-клеток. По сравнению с контрольной группой, мыши модельной группы показали достоверно повышенную экспрессию мРНК Tbx21 (1,68 против 0,61) и Il-17 (26,30 против 0,75) в селезенке (p < 0,05) относительно референсного гена Gapdh.

Рисунок 1: Клиническая оценка отека суставов. (А) мыши модельной группы; (B) Кумулятивная заболеваемость среди мышей модельной группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Проявления отека суставов у контрольной и модельной мышей (n = 4). (A-C) Репрезентативные изображения оценок отека лап и суставов (0,2,4) в контрольной и модельной группах мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Гистологические изменения в голеностопных суставах мышей контрольной и модельной групп, наблюдаемые при окрашивании гематоксилин-эозином. (A) Голеностопный сустав контрольной мыши; (B) Разрыв в кости голеностопного сустава мышиной модельной группы; (C) Синовиальная пролиферация в голеностопном суставе мышей модельной группы. Масштабные линейки = 50 μм (первая колонка), 100 μм (вторая и третья колонки). Изображения на рисунках 3B и 3C сделаны одной и той же мышью, демонстрируя различные патологические фенотипы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Различия в толщине синовиальных суставов голеностопного сустава между контрольной группой и мышами модельной группы (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Гистологические изменения в голеностопных суставах мышей контрольной и модельной групп, наблюдаемые при окрашивании Safranin O-Fast Green. (A) Голеностопный сустав мышей контрольной группы; (Б) Синовиальная пролиферация в голеностопном суставе мышей модельной группы. Масштабные линейки = 50 μм (первая колонка), 100 μм (вторая и третья колонки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Изменения воспалительных факторов, связанных с Т-клетками, и подмножеств у мышей контрольной и модельной групп. (А) экспрессия воспалительных факторов, связанных с Т-клетками, в сыворотке крови мышей контрольной и модельной групп и (В) изменения в субпопуляциях Т-клеток Th1/2/17 и Tregs в селезенке. *p < 0,05, **p < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Критерии оценки артрита. Чтобы оценить артрит, каждая конечность оценивается в соответствии с отеком и эритемой, при этом каждой конечности присваивается оценка от 0 до 6. Баллы для всех четырех конечностей суммируются, чтобы получить общую оценку артрита для каждой мыши.

Таблица 2: Список последовательностей праймеров.

Дополнительный рисунок S1: Стратегия стробирования для сортировки CD4⁺ Т-клеток методом проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Развитие РА тесно связано с аномальной инфильтрацией иммунных клеток в синовиальной ткани, где нерегулируемая активация этих иммунных клеток приводит к высвобождению различных провоспалительных цитокинов, которые в дальнейшем способствуют повреждению синовиальных и суставных структур^18,19. Несколько животных моделей РА были широко оценены, в том числе модель CIA, модель K/BxN и мыши SKG 13,20,21. Несмотря на то, что эти модели успешно воспроизводят иммунные механизмы и клинические проявления РА, все они имеют существенные ограничения. Например, модель CIA на мышах C57BL/6 имеет более низкий процент успеха, более длительный период начала и значительное влияние окружающей среды и экспериментальных условий, что делает ее менее практичной в определенных экспериментальных условиях. Мыши SKG представляют собой мышиную модель RA, основанную на мутации гена ZAP-70, которая вызывает резкую аномалию в передаче сигналов Т-клеточного рецептора (TCR) и индуцирует аутоиммунный артрит²². Однако эта модель дорога, и на воспроизводимость экспериментальных результатов легко влияют условия индукции. K/BxN является моделью наследственного артрита, вызванного совместной активностью Т- и В-клеток, проявляющих выраженный иммунный ответ²³. Тем не менее, построение этой модели является дорогостоящим, а ее специфичность ограничена, что приводит к ограниченному иммунному ответу, который не может полностью охватить многогранный патологический процесс РА человека. Поэтому большое значение имеет разработка животной модели, способной воспроизводить ключевые патологические особенности РА, отвечать различным экспериментальным требованиям и обеспечивать высокую воспроизводимость.

В этом исследовании мы представляем метод создания модели РА через адоптивный перенос адаптивных CD4⁺ Т-клеток от мышей SKG. Построение этой модели основано на отборе CD4⁺ Т-клеток у мышей SKG с фоном C57/BL6 и индукции маннана, что обеспечивает успех модели. Широко известно, что мыши SKG на фоне BALB/c являются носителями спонтанной мутации гена ZAP70 (W163C), которая вызывает аномальный отбор сигналов TCR, приводящий к высокосамореактивным Т-клеткам²⁴. Это приводит к чрезмерной активации Т-клеток и возникновению синовита и разрушения суставов, тем самым имитируя ключевые патологические процессы РА, такие как восстановление синовиальной оболочки и активация иммунных клеток^25,26. Клинические особенности мышей SKG очень похожи на таковые у пациентов с РА человека.

Чтобы ввести эту мутацию в фон C57BL/6, мы использовали технологию CRISPR/Cas9 для успешной генерации модели мыши с фоном C57BL/6 SKG, несущей мутацию ZAP70 (W163C). CRISPR/Cas9 обеспечивает высокую точность и эффективность, позволяя целенаправленно вводить желаемую мутацию при сохранении низкой скорости нецелевого вставки или нежелательных генетических модификаций, связанных с традиционными методами случайной индукции, тем самым обеспечивая стабильность и уникальность модели^27,28. Что еще более важно, этот метод также значительно сокращает время, необходимое для построения модели, повышая как управляемость, так и эффективность разработки моделей. Используя эту модель, мы можем точно воспроизвести Т-клеточный синовит и совместную деструкцию РА на фоне C57BL/6. По сравнению с фоном BALB/C у традиционных мышей SKG, модельные мыши на фоне C57BL/6 имеют более широкое применение в иммунологических исследованиях и могут быть легче комбинированы с другими трансгенными моделями (например, Rag1^-/- или IL17^-/-). Это делает их подходящими для изучения роли мутации ZAP70 в развитии РА и других аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка или рассеянный склероз.

Основываясь на ключевой роли^29,30 CD4⁺ Т-клеток в активации РА, мы выбрали их в качестве ключевых медиаторов. Т-клетки являются основными движущими силами иммунных реакций при РА и могут напрямую вызывать повреждение синовиальной оболочки, активируя субпопуляции эффекторов Th1/Th17³¹, в зависимости от воспалительных факторов, таких как IL-6, IL-17 и TNF-α ^32,33. Являясь ключевыми медиаторами иммунной регуляции, CD4⁺ Т-клетки секретируют провоспалительные цитокины, запуская и поддерживая воспалительный каскад, который приводит к синовиальной пролиферации и повреждению суставов, тем самым непосредственно способствуя патологическому прогрессированию РА. Они играют важную роль в оказании помощи В-клеткам в производстве специфических антител (например, ACPA)³⁴. Между тем, типичным гистопатологическим признаком синовиальной оболочки РА является агрегация CD4⁺ Т-клеток. Некоторые гены главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II, особенно «общие эпитопы», связанные с изотипом антиген-DR лейкоцитов человека (HLA-DR), считаются тесно связанными с патогенезом RA³⁵. Кроме того, стратегия блокирования костимуляции Т-клеток цитотоксическим Т-лимфоцит-ассоциированным антигеном 4 (CTLA4)-Ig продемонстрировала значительную клиническую эффективность при РА³⁶. Кроме того, индукция маннана служит мощным активатором для модели, способствуя активации компонентов врожденного иммунитета, таких как дендритные клетки и макрофаги³⁷. Этот шаг еще больше способствует активации CD4⁺ Т-клеток и иммунным реакциям, значительно увеличивая атаку иммунной системы на собственные ткани, тем самым моделируя патологические особенности иммунной дисрегуляции и повреждения синовиальной оболочки при РА.

После завершения модельной индукции мы провели систематическую верификацию модельной группы по нескольким параметрам, включая клиническую оценку отека суставов, патологическую валидацию (наблюдение за патологией тканей синовита и особенностями разрушения суставов) и иммунологическую валидацию (экспрессию клеток Th1/2/17 и Treg в сыворотке крови и селезенке). Результаты показали, что наша модель успешно реплицировала Т-клеточный синовит и разрушение суставов при РА, индуцируя характерную иммунную активацию и синовиальные патологические изменения, согласующиеся с основными патофизиологическими механизмами РА, со 100% распространенностью. Примечательно, что в нашей модели клинический показатель опухших суставов у мышей достигает пика через 1 неделю, показывает заметное снижение на второй неделе, а затем постепенно снова повышается на более поздних стадиях, что не совсем соответствует типичному течению заболевания, наблюдаемому в^{обычных животных} моделях артрита. Это может быть связано с тем, что через 1 неделю после индукции иммунная система у модельных мышей находится в интенсивно активированной начальной фазе при введении маннана, что приводит к пику воспаления суставов. На второй неделе иммунная регуляция и механизмы самовосстановления приводят к временному облегчению клинических симптомов. По мере прогрессирования заболевания иммунная толерантность постепенно ослабевает, а иммунный ответ вновь усиливается, что проявляется постепенным ухудшением состояния на более поздних стадиях.

Несмотря на то, что эта модель относительно проста по сравнению с другими моделями, все же есть несколько ключевых моментов, которые необходимо учитывать в процессе моделирования. Во-первых, активность и чистота CD4⁺ Т-клеток мышей SKG составляют основу успеха модели. Чистота ячеек должна превышать 90% для обеспечения согласованности и достоверности экспериментальных результатов. Во-вторых, скорость инъекции в медиальную кантальную вену должна тщательно контролироваться, чтобы избежать разрыва вены из-за слишком быстрой инъекции или утечки клеток из-за слишком медленной инъекции. Кроме того, решающее значение имеет выбор дозы для клеток. Слишком низкая доза может привести к неудаче модели, в то время как слишком высокая доза может вызвать неспецифические воспалительные реакции. Поэтому в процессе моделирования следует внимательно следить за общим состоянием мышей, а любые аномальные симптомы должны регистрироваться незамедлительно, чтобы обеспечить плавный ход эксперимента и научную обоснованность данных.

По сравнению с обычными моделями, эта модель имеет более короткий период приживаемости, достигает более высокого уровня заболеваемости у мышей C57BL/6 и остается относительно экономичной и простой в эксплуатации. Перенос аутореактивных CD4⁺ Т-клеток точно воспроизводит Т-клеточные иммунные реакции и фиксирует ключевые патологические особенности РА, такие как отек и повреждение суставов. Более того, его клинические проявления хорошо согласуются с проявлениями РА человека, предлагая более достоверное отражение клинических и патологических процессов РА. Кроме того, комбинация инфузии медиальной кантальной вены и индукции маннана еще больше улучшает управляемость модели и экспериментальную стабильность, делая ее высоковоспроизводимой и обеспечивая превосходный экспериментальный контроль. Конечно, у этой модели все же есть ограничения. В основном он сосредоточен на иммунных реакциях, управляемых Т-клетками; моделирование совместных ролей В-клеточных ответов антител и других иммунных клеток (таких как естественные киллеры (NK) клетки и Treg-клетки) является недостаточным, что затрудняет полное представление многоклеточных патологических механизмов РА. Тем не менее, эта мышиная модель РА остается стабильной и надежной моделью на животных, предоставляя исследователям лучшую платформу для моделирования иммунных реакций, опосредованных Т-клетками, и основных патологических особенностей РА. Эта модель позволяет исследователям глубоко погрузиться в иммунные механизмы и патологическое прогрессирование РА, предоставляя важные экспериментальные данные и инструменты для разработки новых методов лечения, в частности, для понимания иммунной дисрегуляции, вызванной Т-клетками, и определения терапевтических мишеней.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (82270903, 82401588 и 81974254) и Китайского фонда постдокторантуры (2024M751019).