Method Article
هنا ، نبلغ عن بروتوكول ينشئ نموذج فأر التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) من خلال النقل بالتبني لخلايا CD4 + T من فئران SKG ، مما يوفر أداة تجريبية سريعة وموثوقة للتحقيق في الآليات المناعية ، والتقدم المرضي ، وتطوير علاجات جديدة لالتهاب المفاصل الروماتويدي .
التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو اضطراب التهابي مناعي ذاتي مزمن جهازي قد يؤدي إلى تلف المفاصل والتشوهات والإعاقة وحتى الموت. نظرا لمسببات المرض المعقدة والعرض السريري غير المتجانس ، لا تزال استراتيجيات العلاج الحالية غير كافية في التحكم الفعال في تطور المرض ، لا سيما في تحقيق التشخيص المبكر وتقديم العلاجات الشخصية. لذلك ، فإن تطوير مناهج علاجية جديدة أمر بالغ الأهمية. لتحقيق ذلك ، تعد النماذج الحيوانية الموثوقة ضرورية للتحقيق في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي. حاليا ، يتم استخدام العديد من النماذج الحيوانية لالتهاب المفاصل الروماتويدي ، بما في ذلك نموذج التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين (CIA) ، ونموذج K / BxN ، وفأر SKG. على الرغم من أن هذه النماذج يمكن أن تحاكي بنجاح آليات المناعة والمظاهر السريرية لالتهاب المفاصل الروماتويدي ، إلا أن لكل منها قيودا ملحوظة.
في هذا البروتوكول ، نصف عملية إنشاء نموذج فأر RA من خلال النقل بالتبني لخلايا CD4 + T من فئران SKG. بالمقارنة مع النماذج التقليدية ، يوفر هذا النموذج وقتا أقصر للتأسيس ومعدل حدوث أعلى (100٪) في الفئران C57BL / 6. إنه فعال من حيث التكلفة نسبيا ، ويتضمن إجراءات مباشرة ، ويكرر بشكل موثوق الاستجابات المناعية بوساطة الخلايا التائية ، مما يضمن تحكما تجريبيا فائقا وقابلية للتكاثر. أجرينا تقييما شاملا للنموذج ، وقمنا بتقييم النمط الظاهري السريري مثل أعراض المفاصل. من خلال تقييم النمط الظاهري السريري ، لاحظنا تورما كبيرا في المفاصل واستجابات التهابية. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل لقياس مستويات التعبير عن عوامل النسخ الرئيسية ، وجدنا أن هذا النموذج يحاكي بشكل فعال الاستجابات المناعية بوساطة الخلايا التائية والسمات المرضية الرئيسية لالتهاب المفاصل الروماتويدي. باستخدام هذا النموذج ، يمكن للباحثين محاكاة الاستجابة المناعية بوساطة الخلايا التائية والسمات المرضية الرئيسية لالتهاب المفاصل الروماتويدي بشكل أفضل ، وبالتالي توفير أداة تجريبية موثوقة وفعالة لدراسة آليات المناعة والتقدم المرضي وتطوير علاجات جديدة لالتهاب المفاصل الروماتويدي.
التهاب المفاصل الروماتويدي هو مرض التهابي مناعي ذاتي مزمن وجهازي يصيب ما يقرب من 1٪ من سكان العالم ، مما يسبب اعتلال المراضة وعبء اجتماعي واقتصادي ثقيل1،2. يتميز المرض بالتهاب زليلي مستمر ، وتدمير الغضاريف ، وتآكل العظام ، مما يؤدي في النهاية إلى تشوهات المفاصل ، والإعاقات ، وفي الحالات الشديدة ، الموت المبكر3،4،5. يتضمن التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي التفاعل بين العوامل الوراثية والبيئية والمناعية ، مع ميزات رئيسية بما في ذلك التنشيط غير الطبيعي للمناعة الخلوية ، والإفراط في إطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، وتعطيل التحمل المناعي6،7. في هذه العملية ، تعمل الخلايا التائية ذاتية التفاعل ، وخاصة الخلايا التائية CD4 + ، كمحركات رئيسية لتنظيم المناعة ، على تعزيز التقدم المرضي لالتهاب المفاصل الروماتويدي بشكل مباشر من خلال آليات متعددة.
تنتج الخلايا التائية المساعدة (Th) 1 إنترفيرون جاما (IFN-γ) ، والذي ينشط البلاعم والخلايا الليفية الزليلية ، مما يؤدي إلى إطلاق عامل نخر الورم (TNF) -α والإنترلوكين (IL) -6 والتسبب في التهاب الغشاء المفصلي. تفرز خلايا Th17 IL-17 ، مما يعزز تنشيط الخلايا الزليلية وناقضات العظم ، مما يؤدي إلى تفاقم تدمير الغضاريف وتآكل العظام8،9. بالإضافة إلى ذلك ، تعمل خلايا CD4 + T على تضخيم الاستجابات الالتهابية عن طريق تنشيط الخلايا البائية من خلال إشارات التحفيز المشترك ، مما يؤدي إلى إنتاج الأجسام المضادة للبروتين المضاد للسيترولين (ACPA) والعوامل الروماتويدية (RF) 10. وفي الوقت نفسه ، تعد العيوب في الوظيفة وانخفاض عدد خلايا Treg من الأسباب الرئيسية لعدم التوازن المناعي في التهاب المفاصل الروماتويدي ، مما يؤدي إلى التهاب غير منضبط11،12. نظرا للمسببات المعقدة والعرض السريري غير المتجانس ، فإن التشخيص المبكر صعب ، والعلاج الحالي لالتهاب المفاصل الروماتويدي غير مرض. لذلك ، فإن تطوير مناهج علاجية جديدة أمر بالغ الأهمية. تعتبر النماذج الحيوانية الموثوقة ضرورية للتحقيق في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي لاكتساب فهم أعمق للآليات المحتملة لالتهاب المفاصل الروماتويدي واستكشاف استراتيجيات علاج جديدة.
تساهم نماذج RA التقليدية ، مثل نماذج الماوس CIA و K / BxN13،14،15 ، في تحسين فهمنا ل RA. ومع ذلك ، تظهر هذه النماذج قيودا كبيرة. على سبيل المثال ، يتمتع نموذج وكالة المخابرات المركزية في الفئران C57BL / 6 بمعدل نجاح منخفض وفترة تحريض طويلة ، مما يقلل من فائدته في بعض الإعدادات التجريبية. وبالمثل ، على الرغم من أن نموذج K / BxN ذو قيمة ، إلا أنه مكلف وله قيود في تكرار الأمراض المعقدة لالتهاب المفاصل الروماتويدي البشري ، لا سيما التفاعلات بين الخلايا المناعية والسيتوكينات.
لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير نموذج فأر RA جديد عن طريق نقل خلايا CD4 + T من الفئران SKG ذات خلفية C57BL / 6 إلى فئران C57BL / 6 ذات الكفاءة المناعية ، بالاشتراك مع التنشيط المناعي الناجم عن المانان. يكرر هذا النموذج بشكل فعال السمات الرئيسية لالتهاب المفاصل الروماتويدي ، بما في ذلك الاستجابات المناعية بوساطة الخلايا التائية والخصائص المرضية الأساسية مثل الالتهاب الزليلي وتآكل المفاصل ، مع تقديم مزايا في التكاثر والبساطة والفعالية من حيث التكلفة. حددنا منهجية مفصلة لإنشاء هذا النموذج ، والتي تتضمن توليد فئران SKG على خلفية C57BL / 6 ، وعزل خلايا CD4 + T من فئران SKG ، ونقلها بالتبني ، والتحريض اللاحق بواسطة مانان. بالإضافة إلى ذلك ، نصف المعايير السريرية والنسيجية المستخدمة لتقييم شدة التهاب المفاصل ، وضمان موثوقيته وقابليته للتكاثر. من خلال محاكاة الاستجابات المناعية بوساطة الخلايا التائية باستمرار والسمات المرضية الأساسية لالتهاب المفاصل الروماتويدي ، يعمل هذا النموذج كأداة تجريبية قوية وفعالة للتحقيق في آليات المناعة وتطور المرض وتطوير علاجات جديدة لالتهاب المفاصل الروماتويدي.
اتبعت جميع الإجراءات التجريبية في هذه الدراسة بدقة المبادئ التوجيهية المنصوص عليها في "دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر" ، بما في ذلك تربية والعمليات التجريبية والقتل الرحيم ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات التابعة لكلية الطب تونغجي ، جامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا.
1.
2. عزل وتنقية الخلايا التائية CD4 + من فئران SKG
3. النقل بالتبني لخلايا CD4 + T
4. تحفيز وتحريض المانان
5. القياسات
التصنيف السريري لتورم المفاصل ومعدل الإصابة في الفئران
يوضح الشكل 1 التصنيف السريري لتورم المفاصل ومعدل الإصابة في الفئران النموذجية. تشير النتائج إلى أن جميع الفئران في المجموعة النموذجية أصيبت بالمرض (ن = 4) ، بمعدل حدوث 100٪. زادت الدرجات في المجموعة النموذجية بشكل ملحوظ ، وأظهرت ارتياحا قصيرا في الأسبوع الثاني ، وارتفعت لاحقا على مدى 6 أسابيع.
مظهر تورم المفاصل في الفئران
تظهر مفاصل الفئران من المجموعة النموذجية سماكة وتورم كبيرين ، مع تورم وسماكة ملحوظ لوحظ أيضا في الأطراف الأمامية والخلفية (الشكل 2).
النتائج المرضية لمفاصل الكاحل الفأر
تشير النتائج المرضية إلى أنه بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، تظهر الفئران في المجموعة النموذجية سماكة كبيرة في الغشاء الزليلي في مفاصل الكاحل ، وانقطاعا في العظام ، وتجميعا ملحوظا للخلايا الالتهابية (الشكل 3 ، الشكل 4 ، والشكل 5).
العوامل الالتهابية المرتبطة بالخلايا التائية في الدم
بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، أظهرت الفئران في المجموعة النموذجية زيادات كبيرة في مستويات مصل IL-10 (7.51 مقابل 2.15 بيكوغرام / مل) ، TNF (78.83 مقابل 13.11 بيكوغرام / مل) ، IL-17 (101.6 مقابل 12.64 بيكوغرام / مل) ، و IFN-γ (5.15 مقابل 1.90 بيكوغرام / مل) (ص < 0.05). كما زاد IL-6 بشكل ملحوظ مقارنة بالمجموعة الضابطة (15.59 مقابل 6.27 بيكوغرام / مل) (ص = 0.05 ، الشكل 6).
التغييرات في المجموعات الفرعية للخلايا التائية Th1 / 2/17 و Tregs في الطحال
تم قياس مستويات تعبير الرنا المرسال ل Tbx21 (Th1) و Gata3 (Th2) و Il-17 (Th17) و Foxp3 (Tregs) لتقييم التغيرات في المجموعات الفرعية للخلايا التائية في الطحال. تقوم هذه الجينات بتشفير عوامل النسخ الرئيسية والسيتوكينات التي تحدد تمايز ووظيفة المجموعات الفرعية للخلايا التائية الخاصة بها. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، أظهرت الفئران في المجموعة النموذجية زيادة ملحوظة في تعبير mRNA ل Tbx21 (1.68 مقابل 0.61) و Il-17 (26.30 مقابل 0.75) في الطحال (ص < 0.05) بالنسبة للجين المرجعي Gapdh.
الشكل 1: التهديف السريري لتورم المفاصل. (أ) الفئران من المجموعة النموذجية؛ (ب) الوقوع التراكمي في الفئران المجموعة النموذجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مظاهر تورم المفاصل في الفئران الضابطة والنموذجية (ن = 4). (A-C) صور تمثيلية لدرجات تورم المخلب والمفاصل (0،2،4) في مجموعات التحكم والنماذج للفئران. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التغيرات النسيجية في مفاصل الكاحل للفئران الضابطة والمجموعة النموذجية التي لوحظت مع تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين. (أ) التحكم في مفصل الكاحل للفأر. (ب) انقطاع في عظم مفصل كاحل الفأر للمجموعة النموذجية؛ (ج) التكاثر الزليلي في مفصل كاحل الفأر للمجموعة النموذجية. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (العمود الأول) ، 100 ميكرومتر (العمودين الثاني والثالث). الصور في الشكل 3B و 3C مأخوذة من نفس الماوس ، مما يدل على أنماط ظاهرية مرضية مختلفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الاختلافات في السماكة الزليلية لمفاصل الكاحل بين المجموعة الضابطة وفئران المجموعة النموذجية (ص < 0.05). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التغيرات النسيجية في مفاصل الكاحل لفئران المجموعة الضابطة والنموذجية التي لوحظت مع تلطيخ Safranin O-Fast Green. (أ) مفصل الكاحل لفأر المجموعة الضابطة. (ب) التكاثر الزليلي في مفصل الكاحل لفأر المجموعة النموذجية. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (العمود الأول) ، 100 ميكرومتر (العمودين الثاني والثالث). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التغيرات في العوامل الالتهابية المرتبطة بالخلايا التائية والمجموعات الفرعية في الفئران الضابطة والمجموعة النموذجية. (أ) التعبير عن العوامل الالتهابية المرتبطة بالخلايا التائية في مصل الفئران الضابطة والمجموعة النموذجية و (ب) التغيرات في المجموعات الفرعية للخلايا التائية Th1 / 2/17 و Tregs في الطحال. * ص < 0.05 ، ** ص < 0.01. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
نقاط | تورم (النطاق 0-4) | حمامي (النطاق 0-2) |
0 | اي | اي |
1 | أي رقم | طفيف |
2 | مخلب | متطرف |
3 | المعصم / الكاحل | |
4 | طرف كامل |
الجدول 1: معايير تسجيل التهاب المفاصل. لتسجيل التهاب المفاصل ، يتم تسجيل كل طرف وفقا للتورم والحمامي ، مع تخصيص درجة 0-6 لكل طرف. يتم جمع درجات جميع الأطراف الأربعة لتوليد إجمالي درجة التهاب المفاصل لكل فأر.
تسلسل التمهيدي | |
اسم أوليغو | التسلسل من 5 إلى 3 |
Tbx21 إلى الأمام | AGCAAGGAGCGAATGTT |
Tbx21-عكس | GGGTGGACATATAAGCGGTTC |
جاتا 3 إلى الأمام | CTCGGCCATTCGTACATGGAA |
جاتا 3 - عكس | GGATACCTCTGCACCGTAGC |
Il-17A-إلى الأمام | TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA |
Il-17A-عكس | CTTTCCCTCCGCATTGACAC |
Foxp3 إلى الأمام | CCCTTGACCTCAAACCAAG |
Foxp3 - عكس | GTGTGACTGCATGACTAACTTTGA |
جاب إلى الأمام | GGTTGTCTCCTGCGACTTCA |
Gapdh-عكس | TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC |
الجدول 2: قائمة تسلسل التمهيدي.
الشكل التكميلي S1: استراتيجية البوابات لفرز الخلايا التائية CD4 + عن طريق قياس التدفق الخلوي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
يرتبط تطور التهاب المفاصل الروماتويدي ارتباطا وثيقا بتسلل الخلايا المناعية غير الطبيعي في الأنسجة الزليلية ، حيث يؤدي التنشيط غير المنظم لهذه الخلايا المناعية إلى إطلاق العديد من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، والتي تساهم بشكل أكبر في تلف الهياكل الزليلية والمفاصل18،19. تم تقييم العديد من نماذج RA على نطاق واسع ، بما في ذلك نموذج وكالة المخابرات المركزية ، ونموذج K / BxN ، وفئران SKG13،20،21. في حين أن هذه النماذج تكرر بنجاح الآليات المناعية والمظاهر السريرية لالتهاب المفاصل الروماتويدي ، إلا أن جميعها لها قيود كبيرة. على سبيل المثال ، يتمتع نموذج وكالة المخابرات المركزية في الفئران C57BL / 6 بمعدل نجاح أقل ، وفترة ظهور أطول ، ويتأثر بشكل كبير بالظروف البيئية والتجريبية ، مما يجعله أقل عملية في بعض الإعدادات التجريبية. تمثل الفئران SKG نموذجا للفأر RA يعتمد على طفرة جينية ZAP-70 ، والتي تسبب شذوذا مفاجئا في إشارات مستقبلات الخلايا التائية (TCR) وتحفز التهاب المفاصل المناعيالذاتي 22. ومع ذلك ، فإن هذا النموذج مكلف ، وتتأثر قابلية تكرار النتائج التجريبية بسهولة بظروف الحث. K / BxN هو نموذج التهاب المفاصل الوراثي الناجم عن النشاط التعاوني للخلايا التائية والبائية ، مما يظهر استجابة مناعية واضحة23. ومع ذلك ، فإن بناء هذا النموذج مكلف ، وخصوصيته مقيدة ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية محدودة لا يمكنها التقاط العملية المرضية متعددة الأوجه لالتهاب المفاصل الروماتويدي البشري بالكامل. لذلك ، من الأهمية بمكان تطوير نموذج حيواني يمكنه تكرار السمات المرضية الرئيسية لالتهاب المفاصل الروماتويدي ، وتلبية المتطلبات التجريبية المختلفة ، وضمان قابلية عالية للتكاثر.
في هذه الدراسة ، نقدم طريقة لإنشاء نموذج RA من خلال النقل المعتمد لخلايا CD4 + T التكيفية من فئران SKG. يعتمد بناء هذا النموذج على اختيار خلايا CD4 + T من فئران SKG ذات خلفية C57 / BL6 وتحريض مانان ، وهي عملية تضمن نجاح النموذج. من المعروف على نطاق واسع أن فئران SKG على خلفية BALB / c تحمل طفرة جينية تلقائية ZAP70 (W163C) ، مما يتسبب في اختيار إشارات TCR غير طبيعي ، مما يؤدي إلى خلايا تائية شديدة التفاعلذاتيا 24. ينتج عن هذا التنشيط المفرط للخلايا التائية وظهور التهاب الغشاء المفصلي وتدمير المفاصل ، وبالتالي محاكاة العمليات المرضية الرئيسية لالتهاب المفاصل الروماتويدي مثل الإصلاح الزليلي وتنشيط الخلايا المناعية25،26. تشبه السمات السريرية لفئران SKG إلى حد كبير تلك الخاصة بمرضى التهاب المفاصل الروماتويدي البشري.
لإدخال هذه الطفرة في خلفية C57BL / 6 ، استخدمنا تقنية CRISPR / Cas9 لإنشاء نموذج ماوس Skg بخلفية C57BL / 6 بنجاح يحمل طفرة ZAP70 (W163C). يوفر CRISPR / Cas9 دقة وكفاءة عالية ، مما يتيح الإدخال المستهدف للطفرة المطلوبة مع الحفاظ على معدل منخفض من الإدراج خارج الهدف أو التعديلات الجينية غير المرغوب فيها المرتبطة بطرق الحث العشوائي التقليدية ، وبالتالي ضمان استقرار النموذج وتفرده27،28. والأهم من ذلك ، أن هذه التقنية تقلل أيضا بشكل كبير من الوقت اللازم لبناء النموذج ، مما يعزز كل من إمكانية التحكم وكفاءة تطوير النموذج. باستخدام هذا النموذج ، يمكننا تكرار التهاب الغشاء المفصلي بوساطة الخلايا التائية وتدمير المفاصل لالتهاب المفاصل الروماتويدي بدقة على خلفية C57BL / 6. بالمقارنة مع خلفية BALB / C في فئران SKG التقليدية ، فإن الفئران النموذجية على خلفية C57BL / 6 لها قابلية تطبيق أوسع في البحوث المناعية ويمكن دمجها بسهولة أكبر مع النماذج المعدلة وراثيا الأخرى (على سبيل المثال ، Rag1 - / - أو IL17 - /-). هذا يجعلها مناسبة للتحقيق في دور طفرة ZAP70 في التهاب المفاصل الروماتويدي وأمراض المناعة الذاتية الأخرى مثل الذئبة الحمامية الجهازية أو التصلب المتعدد.
بناء على الدور المحوري29,30 لخلايا CD4 + T في تنشيط RA ، اخترناها كوسطاء رئيسيين. الخلايا التائية هي الدوافع الأساسية للاستجابات المناعية في التهاب المفاصل الروماتويدي ويمكن أن تسبب الضرر الزليلي بشكل مباشر عن طريق تنشيط المجموعات الفرعية المستجيب Th1 / Th1731 ، اعتمادا على العوامل الالتهابية مثل IL-6 و IL-17 و TNF-α32،33. كوسطاء محوريين لتنظيم المناعة ، تفرز خلايا CD4 + T السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، مما يؤدي إلى الشلال الالتهابي ويحافظ عليه ، مما يؤدي إلى التكاثر الزليلي وتلف المفاصل ، وبالتالي يعزز بشكل مباشر التقدم المرضي لالتهاب المفاصل الروماتويدي. إنها مفيدة في مساعدة الخلايا البائية في إنتاج أجسام مضادة محددة (على سبيل المثال ، ACPA) 34. وفي الوقت نفسه ، فإن السمة النسيجية المرضية النموذجية لغشاء روماتويا الروماتويدي هي تجميع الخلايا التائية CD4 +. تعتبر بعض جينات مركب التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الثانية (MHC) ، وخاصة "الحلقات المشتركة" المتعلقة بالنمط المنظور لمستضد الكريات البيض البشرية (HLA-DR) ، مرتبطة ارتباطا وثيقا بالتسبب في RA35. علاوة على ذلك ، أظهرت استراتيجية منع التحفيز المشترك للخلايا التائية مع المستضد 4 المرتبط بالخلايا الليمفاوية التائية السام للخلايا (CTLA4) -Ig فعالية سريرية كبيرة في RA36. بالإضافة إلى ذلك ، يعمل تحريض المانان كمنشط قوي للنموذج ، مما يعزز تنشيط المكونات المناعية الفطرية مثل الخلايا المتغصنة والضامة37. تسهل هذه الخطوة أيضا تنشيط الخلايا التائية CD4 + والاستجابات المناعية ، مما يزيد بشكل كبير من هجوم الجهاز المناعي على الأنسجة الذاتية ، وبالتالي محاكاة السمات المرضية لخلل التنظيم المناعي والضرر الزليلي في التهاب المفاصل الروماتويدي.
بعد الانتهاء من تحريض النموذج ، أجرينا تحققا منهجيا لمجموعة النموذج باستخدام معلمات متعددة ، بما في ذلك التسجيل السريري لتورم المفاصل ، والتحقق المرضي (مراقبة أمراض أنسجة التهاب الغشاء المفصلي وخصائص تدمير المفاصل) ، والتحقق المناعي (التعبير عن خلايا Th1 / 2/17 و Treg في المصل والطحال). أظهرت النتائج أن نموذجنا نجح في تكرار التهاب الغشاء المفصلي بوساطة الخلايا التائية وتدمير المفاصل في التهاب المفاصل الروماتويدي ، مما أدى إلى تنشيط المناعة المميز والتغيرات المرضية الزليلية المتوافقة مع الآليات الفيزيولوجية المرضية الرئيسية لالتهاب المفاصل الروماتويدي ، بمعدل انتشار 100٪. من الجدير بالذكر أنه في نموذجنا ، تظهر درجة المفصل المتورم السريري للفئران في أسبوع واحد انخفاضا ملحوظا في الأسبوع الثاني ، ثم ترتفع تدريجيا مرة أخرى في مراحل لاحقة ، وهو ما لا يتماشى تماما مع المسار النموذجي للمرض الذي لوحظ في النماذج الحيوانية التقليدية لالتهاب المفاصل38. قد يكون هذا بسبب أنه في أسبوع واحد بعد التحريض ، يكون الجهاز المناعي في الفئران النموذجية في مرحلة أولية منشطة بشكل مكثف عن طريق حقن مانان ، مما يؤدي إلى ذروة التهاب المفاصل. في الأسبوع الثاني ، يؤدي التنظيم المناعي وآليات التعافي الذاتي إلى تخفيف مؤقت للأعراض السريرية. مع تقدم المرض ، يتضاءل التحمل المناعي تدريجيا ، ويتم إعادة تكثيف الاستجابة المناعية ، ويتجلى ذلك في التدهور التدريجي للحالة في مراحل لاحقة.
على الرغم من أن هذا النموذج بسيط نسبيا مقارنة بالنماذج الأخرى ، إلا أنه لا تزال هناك العديد من النقاط الرئيسية التي يجب معالجتها أثناء عملية النمذجة. أولا ، يشكل نشاط ونقاء خلايا CD4 + T من فئران SKG الأساس لنجاح النموذج. يجب أن يتجاوز نقاء الخلايا 90٪ لضمان اتساق وموثوقية النتائج التجريبية. ثانيا ، يجب التحكم بعناية في سرعة الحقن في الوريد الكاثال الإنسي لتجنب تمزق الوريد من الحقن بسرعة كبيرة أو تسرب الخلية من الحقن ببطء شديد. علاوة على ذلك ، فإن اختيار جرعة الخلية أمر بالغ الأهمية. قد تؤدي الجرعة المنخفضة جدا إلى فشل النموذج ، في حين أن الجرعة العالية جدا يمكن أن تؤدي إلى استجابات التهابية غير محددة. لذلك ، أثناء عملية النمذجة ، يجب مراقبة الحالة العامة للفئران عن كثب ، ويجب تسجيل أي أعراض غير طبيعية على الفور لضمان التقدم السلس للتجربة والصلاحية العلمية للبيانات.
بالمقارنة مع النماذج التقليدية ، فإن هذا النموذج له فترة إنشاء أقصر ، ويحقق معدل حدوث أعلى في الفئران C57BL / 6 ، ويظل فعالا من حيث التكلفة نسبيا وسهل التشغيل. يؤدي اعتماد نقل خلايا CD4 + T ذاتية التفاعل إلى إعادة إنتاج الاستجابات المناعية بوساطة الخلايا التائية بدقة ويلتقط السمات المرضية الرئيسية لالتهاب المفاصل الروماتويدي ، مثل تورم المفاصل وتلفها. علاوة على ذلك ، تتوافق مظاهره السريرية بشكل جيد مع تلك الموجودة في التهاب المفاصل الروماتويدي البشري ، مما يوفر انعكاسا أكثر أصالة للعمليات السريرية والمرضية لالتهاب المفاصل الروماتويدي. علاوة على ذلك ، فإن الجمع بين تسريب الوريد الكاثال الإنسي وتحريض المانان يحسن من إمكانية التحكم في النموذج واستقراره التجريبي ، مما يجعله قابلا للتكرار بدرجة كبيرة ويوفر تحكما تجريبيا ممتازا. بالطبع ، لا يزال هذا النموذج له قيود. يركز بشكل أساسي على الاستجابات المناعية التي تحركها الخلايا التائية. إن محاكاة الأدوار التعاونية لاستجابات الأجسام المضادة بوساطة الخلايا البائية والخلايا المناعية الأخرى (مثل الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) وخلايا Treg) غير كافية ، مما يجعل من الصعب تمثيل الآليات المرضية متعددة الخلايا لالتهاب المفاصل الروماتويدي بشكل كامل. ومع ذلك ، يظل نموذج فأر RA هذا نموذجا حيوانيا مستقرا وموثوقا به ، مما يوفر للباحثين منصة أفضل لمحاكاة الاستجابات المناعية بوساطة الخلايا التائية والسمات المرضية الرئيسية لالتهاب المفاصل الروماتويدي. يسمح هذا النموذج للباحثين بالتعمق في آليات المناعة والتقدم المرضي لالتهاب المفاصل الروماتويدي ، مما يوفر أدلة وأدوات تجريبية مهمة لتطوير علاجات جديدة ، لا سيما في فهم خلل التنظيم المناعي الذي يحركه الخلايا التائية وتحديد الأهداف العلاجية.
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82270903 و 82401588 و 81974254) ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2024M751019).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose | Yeasen | 10208ES60 | Preparing agarose gel for use in DNA electrophoresis experiments |
Anhydrous ethanol | Shanghai HuShi Laboratory Instruments Co., Ltd. | 100009218 | Dehydrating and fixative agent |
ZAP 70 primers | Tsingke | Primers used for detecting ZAP70 gene expression, commonly used in PCR experiments for genotyping mice | |
0.5 M EDTA solution (pH = 7.4) | Biosharp | R00521 | Used for decalcification to ensure the quality of tissue sections and staining for calcium-containing tissues, while maintaining the structural integrity of the tissue |
1.5 mL enzyme-free ep tubes | LABSELECT | MCT-001-150-S | Used for a variety of experiments such as sample storage, centrifugal separation, etc |
2x Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal) | ToloBio | 22204 | Used for performing highly specific and highly sensitive qPCR reactions. |
2x Magic Green Taq SuperMix | TOLOBIO | 21502-04 | Buffer solution for pre-electrophoresis |
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution | Biosharp | BL539A | Used as a fixative to preserve tissue structure and cellular morphology, providing stable and well-preserved samples for subsequent staining steps |
Animal tissue/cell total RNA isolation kit | Servicebio | MPC2409122 | Extraction of total RNA from animal tissues/cells |
BD Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit | BD Biosciences | 560485 | Measure the expression of Th1/2/17 cytokines in mouse serum. |
Cell Culture dish | LABSELECT | 12211 | A container for cell fluid from the spleen and lymph nodes |
Dimethylbenzene | China National Pharmaceutical Group Chemical Reagents Co., Ltd. | 10023418 | Used as a deparaffinizing and clearing agent |
Easyfive six-port cell counting chamber | CytoEasy | N3EF110 | Used for cell counting |
Enhanced Safranin O-Fast Green staining solution for cartilage. | Solarbio | G1371 | Stain cartilage and bone tissues to observe pathological changes in the joint area. |
Glass slide | CITOTEST | 188105 | Basic support for tissue slicing |
Hematoxylin staining solution | Servicebio | G1005-1 | Dying |
Hematoxylin staining solution | Servicebio | G1001 | Dying |
Low-speed refrigerated centrifuge | Cence | F14300021010004 | It is used for centrifugation and precipitation |
Mannan | Sigma | m7504 | Activator for the model.Dissolve in sterile PBS at 2 mg/mL, mix thoroughly, and filter through a 0.22 μm membrane to eliminate any particles or possible sources of contamination. |
MojoSort Magnet | Biolengend | 480019 | Used for isolating and purifying CD4+ T cells from spleen, lymph nodes of mice |
MojoSort Mouse CD4 T Cell Isolation Kit | Biolengend | 480033 | Used for isolating and purifying CD4+ T cells from spleen, lymph nodes of mice . Use a negative selection method that directly binds to the CD4 molecule to isolate CD4+ T cells, preserving the integrity of surface antigens without affecting CD4 molecule functionality, making it suitable for CD4+ T cell infusion experiments. |
Nano-300 | ALLSHENG | AS-11020-00 | Accurate detection of nucleic acids, proteins, and cellular solutions |
Neutral resin mounting agent | Biosharp | BL704A | Fix and preserve stained tissue sections |
Paraffin microtome | KEDEE | KD-3389 | Used for paraffin sections |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Pricella | WHB824P281 | Used as a buffer solvent or cleaning agent, |
Sterile cell filter (70 µm) | Biosharp | BS-70-CS | Remove large impurities or aggregated cell clusters from the cell suspension to ensure sample purity and cell uniformity |
Sterile syringe (1 mL) | Lingyang Medical Apparatus | 20241020 | Injection into the inner canthal vein |
Tabletop high-speed microrefrigerated centrifuge | SCILOGEX | S1010E | Used for centrifugation and precipitation |
TEA Buffer (50x) | Yeasen | 60116ES76 | Stabilizes pH, helps protect and preserve molecules like DNA and RNA, used in electrophoresis experiments |
ToloScript All-in-one RT EasyMix for qPCR | ToloBio | 22107 | Used to convert RNA templates into cDNA, facilitating subsequent gene expression analysis, qPCR, and other molecular biology experiments. |
Transefer Pipettes | BIOFIL | 240515-133-A | Used for transferring solutions |
Trypan blue dye solution | Biosharp | 7009529 | Commonly used for cell viability assays, helps differentiate live cells from dead cells |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved