Визуализация живых клеток с помощью покадровой съемки для изучения кинетики пролиферации эпидермальных кератиноцитов

Здесь мы предлагаем метод визуализационного анализа живых клеток, который можно использовать для ручного отслеживания линий кератиноцитов пассажа 0 и который позволяет собирать метрики пролиферации, включая судьбу деления клеток и продолжительность клеточного цикла.

Визуализация живых клеток является развивающимся и довольно сложным методом изучения поведения кератиноцитов in vitro. Исторически сложилось так, что поведение деления кератиноцитов изучалось с помощью таких методов, как клональный анализ, иммуноокрашивание и анализ клеточного цикла. Ни один из этих методов не позволяет анализировать поведение кератиноцитов на уровне отдельных клеток в режиме реального времени. В течение последнего десятилетия группы использовали визуализацию живых клеток для идентификации кератиноцитарных стволовых клеток и фиксированных предшественников без необходимости мечения. Были выявлены различия в поведении деления каждой соответствующей группы, скорости терминальной дифференцировки и продолжительности клеточного цикла. В данной статье описывается метод визуализации живых клеток кератиноцитов с помощью покадровой съемки и ее анализ. Использование непассаженных кератиноцитов рекомендуется для этого метода, чтобы наиболее точно имитировать поведение in vivo . Визуализация живых клеток предоставляет уникальную возможность изучать поведение стволовых клеток и коммитированных предшественников на уровне отдельных клеток и определять судьбу деления, продолжительность клеточного цикла, а также другие показатели пролиферации.

Возможность визуализации клеточных популяций in vitro в режиме реального времени по мере их увеличения в течение длительных периодов времени является уникальным преимуществом визуализации живых клеток. Визуализация живых клеток позволяет оценить подвижность, миграцию и пролиферацию клеток на уровне отдельных клеток. Целью этого протокола является оптимизация визуализации культур кератиноцитов с помощью покадровой фотосъемки и создания видео, которые затем можно отслеживать вручную для получения подробных данных о клеточном поведении.

Мы уделяем особое внимание кинетике распространения. На основе анализа видеозаписей визуализации живых клеток можно выяснить деревья линий и оценить время между делениями (показатель продолжительности клеточного цикла), а также пропорции делений, которые приводят к дальнейшему делению в сравнении с дифференцировкой дочерних клеток.

Существует значительная вариабельность от донора к донору при работе с первичными кератиноцитами и частые неудачные попытки размножения клеток. Из-за этого многие исследователи предпочитают использовать высокопролиферативные кератиноциты, такие как клетки HaCaT или неонатальные кератиноциты, часто после того, как они претерпели множественные пассажи in^{vitro 1}. Культивирование первичных кератиноцитов из кожи взрослого или пожилого человека с целью отслеживания родословной может быть сложной задачей. Тем не менее, существуют проблемы с использованием пассажных клеток из клеточных линий или из мужской крайней плоти. Повторное пассирование приводит к образованию клеток, которые значительно отличаются от их состояния in vivo ². Кроме того, было показано, что клетки HaCaT реагируют иначе, чем первичные кератиноциты в множественных анализах ^3,4,5. Для использования клеток, которые наиболее близки к своим аналогам in vivo, используются кератиноциты пассажа 0 от взрослых доноров человека. Кератиноцитарные стволовые клетки и коммитированные предшественники демонстрируют явные различия в поведении, что позволяет различать колонии из любой популяции с помощью визуализации живых клеток⁶. Эта относительно новая способность визуализировать поведение одиночных кератиноцитов в долгосрочной перспективе была использована только в нескольких предыдущих исследованиях с использованием аналогичных методов ^6,7,8. Этот протокол описывает визуализацию первичных кератиноцитов в живых клетках с помощью системы анализа живых клеток IncuCyte S3. На основе построенных деревьев линий можно определить тип колонии (стволовые клетки против фиксированного предшественника), а также продолжительность клеточного цикла и долю делений дифференцировки.

Данное исследование было выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией. Все человеческие ткани были получены после одобрения институционального наблюдательного совета (IRB) Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF), и было получено согласие на все используемые ткани.

1. Покадровая фотосъемка прохождения 0 кератиноцитов человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол специфичен для IncuCyte S3 и SX5.

1. Убедитесь в том, что получены соответствующие разрешения от исследовательского комитета учреждения на людях для использования человеческих тканей в исследовании.
2. Выделите кератиноциты из свежей кожи, как описано ранее⁹.
3. Определите плотность заделки семян для проведения пробы. Проведите пилотные исследования с образцами при многократном разведении от разных доноров, чтобы понять плотность клеток, необходимую для обеспечения достаточного количества колоний для исследования, но предотвращения чрезмерного количества колоний, которые приводят к перекрытию колоний в течение периода наблюдения. Запускайте эти пилотные проекты в идентичных экспериментальных условиях (с теми же планшетами, реагентами и т. д.), так как эти факторы могут изменить результаты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком низкая плотность посева приводит к недостаточному росту, в то время как слишком высокая плотность посева приводит к невозможности точного отслеживания клеток из-за скученности клеток в поле.
   1. Для кератиноцитов Passage 0 из крайней плоти новорожденных в течение 48 ч из коллекции, хранящейся при 4 °C в среде сбора, обеспечьте плотность посева 1000-5000/^см2. Для кератиноцитов Р1 используйте 500-2000 клеток/см² . Чем дальше проход, тем ниже плотность заделки семян.
4. Ячейки пластины на выбранном размере пластины.
   Примечание: 96-луночные планшеты и микропланшеты обладают менисковым эффектом, что приводит к неравномерному распределению клеток, при этом большая часть роста находится за пределами поля тепловизора. Планшеты с большими лунками (например, 24-луночные планшеты) позволяют собирать больше данных. Планшеты с 24 скважинами позволяют визуализировать до 36 месторождений, в то время как планшеты с 96 скважинами позволяют визуализировать до 5 месторождений. Тем не менее, количество полей, захватываемых прибором, конечно, и большее количество полей будет использовать большую часть емкости тепловизора. Как правило, используется 24-луночная пластина.
   1. Чтобы добиться равномерного распределения ячеек на пластине, можно использовать различные методики. Во-первых, вместо того, чтобы засевать каждую лунку по отдельности, выделите общую среду, необходимую для всех лунок, при определенном разведении в микротрубку. Затем пипеткой нанесите общее количество клеток, необходимое для того, чтобы аликвота достигла желаемой плотности, и аккуратно переверните трубку, чтобы равномерно распределить клетки.
   2. После нанесения покрытия переместите пластину крестообразно три раза (вверх-вниз, влево-вправо) и затем аккуратно перенесите в инкубатор.
      ВНИМАНИЕ: При использовании микропланшета избегайте внешних рядов и столбцов лунок, так как интервальная съемка микроскопа выделяет тепло при визуализации и может вызвать испарение среды в этих лунках. Экспериментальные лунки должны быть сгруппированы в центре планшета и окружены лунками, содержащими PBS или другую стерильную жидкость с максимальной производительностью для уменьшения эффектов испарения/краев.
5. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C и 5%_CO2 для обеспечения прилипания.
6. Смените носитель через 24 часа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не тревожьте растущий монослой при отсасывании. Всегда используйте подогретую среду (37 °C) и аккуратно направляйте среду в лунки с помощью боковой стенки. Здесь используется среда Epilife/Supplement S7/Primocin. Для этого применения рекомендуется использование антибиотиков в средах для долгосрочной визуализации живых клеток. Расширенное культивирование в машине, используемой для нескольких одновременных экспериментов, подвержено высокому риску заражения. Обычно используются пенициллин и стрептомицин.
7. Откройте инкубатор, нажав большую треугольную кнопку в левом нижнем углу, чтобы открыть лоток, когда загорится зеленый свет. Поставьте судно в открытую бухту. Затем закройте лоток с помощью той же кнопки в левом нижнем углу. Никогда не открывайте лоток, когда кнопка для открытия горит красным, так как это означает, что сканирование активно сканирует, и сканирование будет прервано.
   ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что сканирование не происходит, начиная с просмотра экрана на модуле контроллера. Он показывает время до следующего сканирования и продолжительность сканирования. Если сканирование началось, оно даст время до завершения сканирования.
8. Откройте приложение на компьютере и авторизуйтесь, используя соответствующий идентификатор пользователя и пароль. Выберите Расписание.
9. Нажмите кнопку + в верхнем левом углу под графиком, чтобы добавить табличку в расписание.
10. Выберите «Сканировать по расписанию», затем нажмите «Далее».
11. Выберите «Создать», затем нажмите «Далее».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если эта пластина идентична предыдущему или выполняемому эксперименту, можно использовать команды «Копировать предыдущий » или «Копировать текущий » для ускорения форматирования эксперимента.
12. Выберите «Стандартный » в качестве типа сканирования, затем нажмите «Далее».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Image Lock - это запатентованная 96-луночная пластина, которая помогает свести к минимуму потерю фокуса/скачки изображения, что может быть полезно при возникновении этих проблем. Другие типы сканирования не особенно полезны для отслеживания родословной.
13. Для настроек сканирования выберите «Адгезивная ячейка за ячейкой », используя фазовый канал при 10-кратном заце, затем нажмите «Далее».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбран фазовый канал, на этом этапе нет необходимости выбирать опцию анализа, так как анализ может быть начат после сбора данных.
14. Выберите судно, затем нажмите «Далее». Большинство распространенных сосудов совместимы с аппаратом, хотя для немикропланшетов могут потребоваться специальные насадки, чтобы поместиться в отсеки интервального микроскопа.
15. Выберите пустой отсек для размещения судна, затем нажмите «Далее».
16. Выберите лунки для сканирования, а также изображения для каждой лунки, затем нажмите «Далее». Предполагаемая продолжительность сканирования будет указана в левом нижнем углу экрана.
17. Присвойте эксперименту имя, используя нужное соглашение об именовании. Создайте карту эксперимента на планшете для дальнейшего использования, затем нажмите «ОК». Наконец, нажмите «Далее».
18. Отложите анализ до окончания сбора данных, так как поэлементный анализ должен быть начат после завершения сканирования. Нажмите Далее.
19. Наконец, установите частоту визуализации. Чтобы надежно отслеживать митозы, которые происходят в течение 30 минут, сканируйте кератиноциты с интервалом в 20 минут. Нажмите Next и подтвердите настройки, чтобы начать эксперимент.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время сканирования не может перекрываться, и производители рекомендуют, чтобы устройство находилось в состоянии покоя в течение всего сканирования. С интервалом в 20 минут это означает, что на сканирование должно быть потрачено максимум 10 минут. Если 12 лунок из 24 луночных планшетов визуализируются с 36 видами на лунку, сканирование занимает 7 минут, поэтому при планировании всегда учитывайте ресурсы, доступные для эксперимента.
    1. Есть уведомление, если у машины недостаточно времени для отдыха, и если время сканирования перекрывается, то судно не может быть добавлено в расписание. Если судно не вписывается в расписание с регулярным интервалом, нажмите «Зарезервировать местоположение лотка » и нажмите «Далее».
    2. Дважды кликните по расписанию в верхней части экрана и выберите судно в резерве, затем вручную нажмите, чтобы добавить изображения на открытые временные интервалы. Либо щелкните правой кнопкой мыши после открытия расписания, чтобы удалить все запланированное время сканирования, и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы установить новое время сканирования для группы сканирования через равные промежутки времени.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Это прервало бы все эксперименты на машине до тех пор, пока не будет установлено новое время. Не забудьте нажать на иконку дискеты для сохранения или на красный крестик, чтобы отменить изменения в расписании. Выбор нужных скважин или видов является простым процессом, так как машина сразу же предоставляет расчетное время сканирования после выбора параметра. Продолжительность сканирования зависит от типа и марки выбранной пластины, а также от количества лунок или видов для сканирования. Это позволяет пользователям настраивать параметры сканирования в соответствии с производительностью машины.
20. Для кератиноцитов меняйте среду каждые 48 ч. Чтобы обеспечить правильную ориентацию пластины, дождитесь завершения первого сканирования каждый раз, когда сосуд помещается в машину (если позволяет время). Это простая ошибка. Поместите табличку в машину так, чтобы буквы, обозначающие ряды, находились с левой стороны пролета.
    1. Чтобы просмотреть сканы, нажмите кнопку «Просмотр» со значком глаза , а затем дважды щелкните эксперимент. Рассмотрите возможность ранней смены среды, если происходит резкое изменение цвета среды (фенолсодержащая красная среда становится желтой из-за закисления), если присутствует избыток мертвых клеток (может препятствовать размножению живых колоний) или если наблюдается аномальная морфология.
21. Как только все скважины станут спокойными или достигнут слияния, экспортируйте эксперимент. Наблюдайте за взрослыми колониями в течение ~2 недель и за новорожденными в течение ~10 дней, после чего скученность приводит к снижению отдачи от анализов.
22. Чтобы экспортировать, перейдите на вкладку « Вид » и дважды щелкните эксперимент под списком последних сканирований (по умолчанию они упорядочиваются от самого последнего в обратном направлении). Нажмите на значок «Альбом » со стрелкой и дождитесь запуска инструмента экспорта.
23. Нажмите «Как отображается», затем нажмите «Далее».
24. Вручную щелкните каждое поле представления для экспорта, затем нажмите «Далее».
25. Выберите, требуется ли фильм или серия изображений, а затем выберите время сканирования для экспорта. Для отслеживания линии кератиноцитов используйте опцию «Фильм» и выберите все сканирования (для ускорения этого есть значок быстрого выбора всех с пунктирной линией). Нажмите Далее.
26. Экспортируйте со скоростью 1 кадр в секунду при максимальном качестве (установите это с помощью полоски рядом с качеством). Нажмите Далее.
27. Выберите целевую папку и тип файла. Присвойте файлу имя и нажмите кнопку «Экспорт».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспорт видео может занять много времени, в зависимости от скорости подключения к Интернету и задействованного компьютера. Будьте готовы ждать несколько дней, чтобы экспортировать все видеофайлы для более крупных экспериментов. Возможность удаленного входа в систему покадровой съемки чрезвычайно удобна.

2. Использование покадровой визуализации для построения деревьев родословной и создания таблиц данных

1. Откройте видеофайл с помощью медиаплеера. Рекомендуется использовать медиаплеер VLC.
2. Прокрутите видео и определите растущие колонии. В VLC используйте клавишу со стрелкой для пропуска кадров вперед и назад. Сделайте скриншот колонии, которую нужно отслеживать, и пометьте колонию.
3. Определите интересующую вас колонию в конце или после нескольких дней видеозаписи, затем перемотайте видео назад и определите клетку, образующую колонию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Именно здесь важно иметь соответствующую плотность посева. Если слишком много колоний развиваются рядом друг с другом, они расширяются и сливаются друг с другом, что делает невозможным точное отслеживание делений клеток.
4. Когда клетка собирается делиться, кажется, что она конденсируется (рис. 1). Поставьте видео на паузу, когда произойдет разделение. Запишите время деления (временная метка находится в левом нижнем углу). Сделайте скриншот этого начального деления и присвойте ему ту же метку, что и колонии. Запишите подразделения на нарисованной от руки схеме родословной (см. Репрезентативные результаты). Продолжайте отслеживать и документировать как можно больше поколений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированное отслеживание клеток было разработано для ускорения этого процесса и более точного отслеживания клеток⁷. Даже в условиях культивирования с низким содержанием кальция и минимальной дифференцировкой моделям машинного обучения в настоящее время не хватает чувствительности для точного отслеживания деления кератиноцитов.
5. Транскрибируйте вручную дерево родословной в таблицы данных - так называемые "зеленые листы" из-за цвета в таблице (Дополнительный файл 1).
6. Используйте зеленые листы для расчета пропорций пролиферативного и дифференцировочного деления, идентификации колоний стволовых клеток и коммитированных прогениторов, а также продолжительности клеточного цикла (см. репрезентативные результаты).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Машина способна анализировать данные с помощью собственных базовых и поклеточных анализаторов для выполнения нескольких других анализов (confluence, scratch). Однако это выходит за рамки данного протокола.

Первичные кератиноциты растут стереотипным образом, что можно отследить с помощью визуализации живых клеток. Медиаплеер VLC используется для просмотра записей. Время до первого деления варьирует и может составлять несколько дней в зависимости от характеристик донора, таких как возраст, состояние здоровья или факторы роста, присутствующие в среде in vitro . При первоначальном посеве кератиноциты имеют маленький, округлой вид (Рисунок 1). После посева колониеобразующие кератиноциты обычно становятся уплощенными (Рисунок 1). Эти уплощенные кератиноциты, как правило, более подвижны, чем их неделящиеся аналоги (Дополнительное видео 1). Непосредственно перед делением уплощенный кератиноцит, по-видимому, конденсируется в центре (Рисунок 1).

За исключением начального деления, 95% кератиноцитов, которые собираются делиться (пролиферативно -), делают это в течение 48 ч от предыдущего деления⁶. Те, которые этого не делают, считаются терминально дифференцированными (D) (Рисунок 1)⁶. Эти дифференцированные клетки остаются адгезивными до конца периода наблюдения или до тех пор, пока они не оторвутся от пластины и не будут удалены при последующей смене среды. Дифференцируемые клетки имеют тенденцию к расширению с течением времени, что приводит к неоднородной морфологии колонии кератиноцитов (Рисунок 1). Экспортируйте видео по окончании периода наблюдения и начните анализ (рис. 2).

Колонии документируются с использованием стандартизированного процесса. Используется видеоприставка, в которой находилась колония (A1, A2..., B1, B2...), за которой следует номер колонии. Например, А2-6 будет видео А2, колония 6. Анализ начинается с отслеживания родословной. Перемотайте вперед до конца видео, чтобы определить колонии, а затем вернитесь к началу периода наблюдения, чтобы определить исходную клетку, образующую колонию. Отслеживайте временные метки всех подразделений по мере их возникновения и создавайте разветвленную диаграмму вручную, отслеживая как можно больше поколений (рис. 3). В конечном итоге уже невозможно точно отслеживать деление клеток из-за плотности клеток (обычно это происходит примерно в 5-7 поколении, в зависимости от того, произошла ли колония от стволовой клетки или от коммитированного предшественника). В более поздних поколениях колония часто сливается с другой колонией, или колония исчезает за кадром. На этом этапе отметьте последнюю отслеживаемую ячейку буквой U (неотслеживаемо). Всегда делайте скриншот отслеживаемой колонии (это можно сделать с помощью функции снимка на VLC) и отмечайте колонию с помощью описанной выше номенклатуры. Обязательно пометьте скриншот стандартизированной номенклатурой, включая конкретное анализируемое видео и номер колонии, который можно сопоставить со скриншотом.

После того, как диаграмма ветвей построена, данные могут быть перенесены в электронную таблицу или «зеленый лист» (Дополнительный файл 1). Зеленый лист содержит одну и ту же метку для каждой колонии, отслеживаемой с помощью диаграммы ветвей. Чтобы упростить идентификацию поколений, цветовые выделения чередуются между поколениями. Время 1 поколения 1 относится к периоду от нанесения покрытия на клетки до их помещения в покадровый микроскоп. В дополнительном файле 1 время 1 поколения 1 составляет 24 часа, так как элементы размещаются на машине через 24 часа после нанесения покрытия. Время 2 представляет собой продолжительность до тех пор, пока клетка не подвергнется своему первому делению. Напомним, что временная метка в видео не учитывает дополнительные 24 часа, поэтому часы нужно вручную добавлять в каждом поколении. При расшифровке данных со схемы ветвей на зеленый лист всегда добавляйте 24 часа к времени делений, так как временная метка, предоставленная машиной, не учитывает время до начала записи. ΔT — продолжительность клеточного цикла. Большинство исследований ^6,8 не включают ΔT первого поколения в анализы, так как она всегда намного больше, чем у последующих поколений, и чрезвычайно изменчива, что приводит к искажению в анализе.

После того, как «зеленый лист» построен, можно определить, какие колонии происходят от стволовых клеток, а какие — от преданных предшественников. Колонии, которые демонстрируют преимущественно пролиферативное деление (рис. 1) и сохраняются до конца периода наблюдения, считаются колониями стволовых клеток⁶. Колонии, которые окончательно дифференцируются (рис. 1) в течение периода наблюдения, считаются преданными колониями-предшественниками⁶. Затем можно рассчитать среднее значение ΔT колоний стволовых клеток и коммитированных колоний-предшественников, соответственно. Разделив долю делений D на общее количество делений, можно рассчитать долю делений дифференцировки либо со всеми объединенными делениями колоний стволовых клеток/коммитированных колоний-предшественников, соответственно, либо по поколениям. Зеленый лист является полезным способом организации данных для эффективного получения информации, и он развивается в зависимости от того, какие данные и статистика необходимы для целей исследования.

Рисунок 1: Изменения в морфологии кератиноцитов, приводящие к делению клеток и терминологии деления. Кератиноциты развиваются через стереотипную последовательность морфологических изменений, ведущих к делению клеток. На этом рисунке изображен кератиноцит, претерпевающий эту последовательность событий с течением времени. Отдельные клетки, которые собираются делиться, подвижны и первоначально приобретают уплощенную морфологию, а непосредственно перед делением конденсируются в центре. Дочерние клетки, которые будут продолжать размножаться, делятся в течение 48 ч после генерации, в противном случае они считаются терминально дифференцированными. Масштабная линейка 400 мкм. Создано в BioRender. Гадиалли, Р. (2025) https://BioRender.com/k40e714 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Экспорт данных с покадровой съемки микроскопа. Руководство по экспорту данных с машины. Создано в BioRender. Гадиалли, Р. (2024) BioRender.com/x99d452 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Диаграмма ветвей предшественника (дерево происхождения) для информирования о создании зеленых листов. Пример дерева родословной, обычно нарисованного от руки. Сокращения: ч: часы, м: мин. Создано в BioRender. Гадиалли, Р. (2025) https://BioRender.com/wbt7z8x Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный файл 1. Примеры технических листов (зеленых листов) неопубликованных данных визуализации живых клеток. Пример зеленого листа, содержащего неопубликованные данные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 1. Пример видео визуализации живых клеток кератиноцитов. Видео визуализации живых клеток с подходящей плотностью клеток для отслеживания колоний кератиноцитов Нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Визуализация кератиноцитов в живых клетках — это метод отслеживания поведения деления стволовых клеток и коммитированных предшественников. Учитывая^{, что} поддержание эпидермиса зависит от кинетики пролиферации стволовых клеток и коммитированных предшественников, детальное понимание изменений в этих популяциях кератиноцитов и того, как они влияют при различных состояниях, облегчает разработку методов лечения для улучшения обнаруженных дефектов.

В конечном счете, отслеживание родословной с помощью визуализации живых клеток зависит от получения пригодных для использования данных. Колониеобразующие единицы должны быть четко видны на видео, полученных с помощью покадровой фотосъемки. При наличии свежевыделенных клеток пассажа 0 получение истинной клональной плотности затруднено. Только 3-4% покрытых кератиноцитов в конечном итоге образуют колонии¹¹. Слишком большое количество клеток может сделать невозможным отслеживание делений или даже идентификацию первоначальной колониеобразующей клетки. Слишком мало клеток, и колонии могут не образоваться. Точно так же все, что заслоняет поле зрения, делает невозможным отслеживание клеток с помощью отслеживания родословной. Использование питателей фибробластов может затруднить отслеживание делений, поскольку фибробласты затеняют поле зрения. Точно так же осадки, клеточный мусор и даже конденсат на крышке пластины могут заслонить растущие колонии. Даже такая мелочь, как неуверенность в том, что микропланшет надежно вставлен в выбранный отсек, может в конечном итоге привести к неудачному эксперименту, поскольку изображение не будет сфокусировано на клетках. Вот почему очень важно ежедневно наблюдать за колониями во время их роста в машине и всегда оставаться там до тех пор, пока не будет произведено первое сканирование, когда микропланшет будет извлечен из машины для смены среды, чтобы убедиться, что клетки захватываются с помощью покадровой фотосъемки. Еще одна проблема, которую может вызвать мусор, — это перепрыгивание изображения. Как правило, микроскоп имеет фиксированные поля зрения, которые не двигаются, но когда накапливается мусор или плотность клеток становится слишком высокой, машина может потерять свое поле зрения и перескочить на другую часть пластины. Чтобы этого избежать, производители аппарата разработали специальный тип 96-луночной пластины с сеткой, предотвращающей потерю фокуса.

Машина выделяет тепло во время съемки. Важно снизить температуру инкубатора, в котором находится микроскоп, до 36,5 °C, чтобы устройство уравновесило до 37 °C при съемке изображений. При использовании планшетов с меньшей площадью поверхности (96-луночные планшеты) учитывайте выделяемое дополнительное тепло. Не используйте для экспериментов периферийные лунки (первый и последний ряды/столбцы) и рассмотрите возможность максимального заполнения лунок, окружающих экспериментальные лунки, другой жидкостью (стерильной PBS), а также используйте дышащую ленту для снижения потерь среды на испарение. На рынке имеются пластины, которые можно было бы исследовать, чтобы свести к минимуму краевые эффекты¹². Тем не менее, вышеупомянутые методы позволили использовать рекомендованные совместимые микропланшеты.

При анализе видео следователи должны быть осведомлены об аномальных закономерностях деления в своих колониях. Например, если в течение 10 дней в поле зрения нет разделений, а затем происходит безудержное образование колоний, происходящее от края поля зрения, маловероятно, что это будет первое деление новой колонии. Вполне вероятно, что растущая колония из окружающего поля зрения посягнула на захваченную часть пластины, а не была новой колонией. В этом можно убедиться, войдя в программный пакет, который может отображать всю пластину (содержащую все записанные виды) в определенные моменты времени и показывать миграцию ячеек из одного поля зрения в другое.

Основным ограничением данного метода является его трудоемкость. Кроме того, отслеживание делений клеток после^5-го поколения является сложным и требует многочасовой работы, пересмотра видео, чтобы точно зафиксировать, что и когда делится. В настоящее время разрабатывается несколько алгоритмов автоматического отслеживания клеток с глубоким обучением, которые в конечном итоге приведут к анализу на основе искусственного интеллекта в ближайшие годы ^7,13,14. До тех пор ручное отслеживание, подобное описанному в этом протоколе, является возможным методом получения данных о происхождении.

Никакой.

Эта работа была поддержана премией Merit Review Award Number I01 CX001816 от Соединенных Штатов (США). Департамент по делам ветеранов Служба клинических исследований и разработок (CSRD). Содержание не отражает точку зрения Министерства по делам ветеранов США или правительства США. Мы благодарим доктора Майкла Розенблюма за предоставленный нам доступ к его покадровому микроскопу для проведения наших экспериментов.