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ここでは、継代0のケラチノサイトの系統を手動で追跡するために使用できるライブセルイメージング解析の方法を提供し、細胞分裂の運命や細胞周期の持続時間などの増殖指標を収集できるようにします。
生細胞イメージングは、 in vitroでケラチノサイトの挙動を研究するための進化途上の、やや挑戦的な方法です。歴史的に、ケラチノサイトの分裂挙動は、クローン解析、免疫染色、細胞周期解析などの方法によって研究されてきました。これらの方法のいずれも、単一細胞レベルでのケラチノサイトの挙動をリアルタイムで解析することはできません。過去10年間、グループはライブセルイメージングを利用して、標識を必要とせずにケラチノサイト幹細胞とコミットされた前駆細胞を同定してきました。それぞれのグループの分裂挙動、終末分化の速度、および細胞周期の持続時間に違いが特定されています。ここでは、タイムラプス撮影によるケラチノサイト生細胞イメージングの方法とその解析方法について説明する。この方法では、イン ビボ の挙動を最も忠実に模倣するために、未継代のケラチノサイトを利用することが推奨されます。ライブセルイメージングは、幹細胞とコミットされた前駆細胞の挙動をシングルセルレベルで研究し、分裂運命、細胞周期の持続時間、およびその他の増殖指標を決定する独自の機能を提供します。
細胞集団が長期間にわたって拡大する様子を in vitro でリアルタイムに可視化できることは、生細胞イメージングのユニークな利点です。ライブセルイメージングでは、細胞の運動性、遊走、増殖をシングルセルレベルで評価することができます。このプロトコルの目標は、タイムラプス写真によるケラチノサイト培養の視覚化を最適化し、手動で追跡して細胞の挙動に関する詳細なデータを取得できるビデオを作成することです。
私たちの焦点は増殖速度論にあります。ライブセルイメージングビデオの解析から、系統樹を解明し、分裂間の時間(細胞周期の持続時間の代理)や、娘細胞のさらなる分裂と分化につながる分裂の割合を評価することができます。
初代ケラチノサイトを扱う際には、ドナー間のばらつきが大きく、細胞増殖の試みが頻繁に失敗する。このため、多くの研究者は、HaCaT細胞や新生児ケラチノサイトなどの増殖性の高いケラチノサイトを使用することを選択します。成人または老化した皮膚から初代ケラチノサイトを培養し、系統追跡を行うことは困難な場合があります。しかし、細胞株や男性の包皮由来の継代細胞の使用には問題があります。継代を繰り返すと、in vivoの状態とは大きく異なる細胞が得られます2。さらに、HaCaT細胞は、複数のアッセイで初代ケラチノサイトとは異なる反応を示すことが示されています3,4,5。in vivoの対応物に最も近い細胞を利用するために、成人のヒトドナーからの継代0ケラチノサイトが利用されます。ケラチノサイト幹細胞とコミットされた前駆細胞は、挙動に明確な違いを示し、これにより、ライブセルイメージング6を介していずれかの集団のコロニーを区別することができます。この比較的新しい能力は、単一ケラチノサイトの長期にわたる挙動を視覚化するもので、同様の技術を用いた以前のいくつかの研究でしか使用されていませんでした6,7,8。このプロトコールでは、IncuCyte S3 Live-Cell Analysis Systemを用いた初代ケラチノサイトのライブセルイメージングについて概説します。構築された系統樹から、コロニーのタイプ(幹細胞とコミットされた祖先)、細胞周期の期間、分化分裂の割合を判断できます。
この研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。すべてのヒト組織は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)の治験審査委員会(IRB)の承認後に取得され、使用されたすべての組織について同意が得られました。
1.通過0人のヒトケラチノサイトのタイムラプス撮影
注:このプロトコルは、IncuCyte S3およびSX5に特有のものです。
2. タイムラプスイメージングによる系統樹の構築とデータシートの生成
初代ケラチノサイトは常同型的に増殖し、ライブセルイメージングで追跡することができます。VLCメディアプレーヤーは、録音の調査に使用されます。最初の分裂までの時間は変動し、年齢、健康状態、 in vitro 環境に存在する成長因子など、ドナーの特性に応じて数日になる場合があります。最初の播種時には、ケラチノサイトは小さく丸みを帯びた外観をしています(図1)。播種後、コロニー形成ケラチノサイトは通常、平らになります(図1)。これらの平坦化されたケラチノサイトは、分裂していないケラチノサイトよりも移動性が高い傾向があります(補足ビデオ1)。分裂する直前に、扁平になったケラチノサイトが中央で凝縮しているように見えます(図1)。
最初の分裂を除いて、分裂する(増殖性-P)ケラチノサイトの95%は、前の分裂から48時間以内に分裂します6。そうでないものは、最終分化型(D)(図1)6と見なされます。これらの分化した細胞は、観察期間が終了するまで、またはプレートから浮き上がり、その後の培地交換で除去されるまで、接着したままになります。分化した細胞は時間の経過とともに増殖する傾向があり、その結果、ケラチノサイトコロニーの形態が不均一になります(図1)。観察期間が終了したらビデオをエクスポートし、解析を開始します(図2)。
コロニーは、標準化されたプロセスを使用して文書化されます。コロニーが位置していたビデオプレフィックス(A1、A2...、B1、B2...)が使用され、その後にコロニー番号が続きます。たとえば、A2-6 はビデオ A2、コロニー 6 になります。分析は、系統トレースから始まります。ビデオの最後まで早送りしてコロニーを特定し、観察期間の最初に巻き戻して元のコロニー形成細胞を特定します。すべてのディビジョンのタイムスタンプを発生時に追跡し、手作業で分岐図を作成して、可能な限り多くの世代を正確に追跡します(図3)。最終的には、細胞密度のために細胞分裂を正確に追跡することは不可能になります(これは通常、コロニーが幹細胞に由来するか、コミットされた前駆細胞に由来するかによって異なりますが、第5世代から第7世代頃に発生します)。後の世代では、コロニーが別のコロニーと合流したり、コロニーが画面から消えたりすることがよくあります。この時点で、最後の追跡可能なセルを U (追跡不能) としてマークします。追跡されているコロニーのスクリーンショットを常に撮り(これはVLCのスナップショット機能を使用して実行できます)、上記の命名法を使用してコロニーをマークします。スクリーンショットには、分析した特定のビデオやスクリーンショットに一致させることができるコロニー番号など、標準化された命名法でラベルを付けてください。
分岐図が構築できたら、スプレッドシートまたは「グリーンシート」(補足ファイル1)にデータを転送できます。緑色のシートには、ブランチダイアグラムで追跡された各コロニーに同じラベルが含まれています。世代を簡単に識別できるように、色のハイライトは世代間で交互に使用されています。第1世代のタイム1は、細胞をプレーティングしてからタイムラプス顕微鏡にセットするまでの期間を指します。補足ファイル1では、第1世代のうち時間1は、めっき後24時間後にセルを機械上に置くため、24時間である。時間 2 は、セルが最初の分裂を経るまでの期間を表します。ビデオのタイムスタンプは追加の 24 時間を考慮していないため、各世代で時間を手動で追加する必要があることを思い出してください。分岐図からグリーンシートにデータを転記するときは、マシンが提供するタイムスタンプが記録開始前の時間を考慮していないため、分割の時間に常に24時間を追加してください。ΔTは細胞周期の持続時間です。ほとんどの研究6,8では、第1世代のΔTは、常に後続世代のΔTよりもはるかに長く、非常に変動するため、分析に偏りが生じるため、分析に含めていません。
グリーンシートが構築されると、どのコロニーが幹細胞に由来し、どのコロニーがコミットされた祖先に由来するかを判断できます。主に増殖性分裂を示し(図1)、観察期間の終わりまで持続するコロニーは、幹細胞コロニー6と見なされます。観察期間中に最終的に分化したコロニー(図1)は、コミットされた祖先コロニー6と見なされます。次に、幹細胞コロニーとコミットされた前駆コロニーの平均ΔTをそれぞれ計算できます。D分裂の割合を総分裂で割ることにより、幹細胞/コミットされた前駆コロニーのすべてのプール分裂について、それぞれ、または世代ごとに、分化分裂の割合を計算できます。グリーンシートは、データを整理して効率的に情報を取得するための便利な方法であり、研究の目標に必要なデータと統計に応じて進化します。
図1:細胞分裂と分裂用語に至るまでのケラチノサイトの形態の変化。 ケラチノサイトは、細胞分裂に至るまでの形態学的変化のステレオタイプなシーケンスを通じて進行します。この図は、時間の経過とともにこの一連のイベントを受けているケラチノサイトを示しています。分裂しようとしている個々の細胞は運動性があり、最初は平らな形態をとり、分裂の直前に中央に凝縮します。増殖を続ける娘細胞は、生成されてから48時間以内に分裂し、そうでなければ末端分化していると見なされます。スケールバー400μm。BioRenderで作成。Ghadially、R.(2025)https://BioRender.com/k40e714 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:タイムラプス顕微鏡からのデータのエクスポート。マシンからデータをエクスポートする方法に関するガイド。BioRenderで作成。Ghadially, R. (2024) BioRender.com/x99d452 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.グリーンシートの作成を通知するための前駆枝図(系統樹)。 系統樹の例で、通常は手描きです。略語:h:時間、m:分。BioRenderで作成。Ghadially, R. (2025) https://BioRender.com/wbt7z8x この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1。未発表のライブセルイメージングデータの例(緑色のシート)。未公開データを含むグリーンシートの例。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ1。ケラチノサイトライブセルイメージングビデオの例。 ケラチノサイトのコロニーを追跡するのに適した細胞密度のライブセルイメージングビデオ このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ケラチノサイトのライブセルイメージングは、幹細胞とコミットされた前駆細胞の分裂挙動を追跡するためのラベルフリーの方法です。表皮の維持が幹細胞とコミットされた前駆細胞の増殖動態に依存していることを考えると10、これらのケラチノサイト集団の変化とそれらがさまざまな条件でどのように影響を受けるかを詳細に理解することは、発見された欠陥を改善するための治療法の開発を促進します。
最終的に、ライブセルイメージングによる系統追跡は、使用可能なデータを取得することにかかっています。コロニー形成ユニットは、タイムラプス写真によって生成されたビデオではっきりと見える必要があります。新たに分離された継代0細胞では、真のクローン密度を得ることは困難です。めっきされたケラチノサイトのわずか3%〜4%が最終的にコロニーを形成します11。細胞が多すぎると、分裂を追跡したり、最初のコロニー形成細胞を特定したりすることができなくなる可能性があります。細胞が少なすぎると、コロニーが形成されない可能性があります。同様に、視野を覆い隠すものはすべて、系統追跡によって細胞を追跡することを不可能にします。線維芽細胞フィーダーを使用すると、線維芽細胞が視野を覆い隠すため、分裂の追跡が困難になる場合があります。同様に、沈殿物、細胞の破片、さらにはプレートの蓋の結露でさえ、成長するコロニーを覆い隠す可能性があります。マイクロプレートが選択したベイにしっかりと挿入されていることを確認しないなどの小さなことでも、画像が細胞に焦点を合わせないため、最終的には実験が失敗する可能性があります。そのため、コロニーがマシン内で成長している間、コロニーを毎日監視し、最初のスキャン後、つまりマイクロプレートをメディア交換のためにマシンから取り外すたびに、常に滞在して、細胞がタイムラプス写真によってキャプチャされていることを確認することが非常に重要です。破片が引き起こす可能性のある別の問題は、画像のジャンプです。通常、顕微鏡は動かない固定視野を持っていますが、破片が蓄積したり、細胞密度が高くなりすぎると、機械は視野を失い、プレートの別の部分にジャンプする可能性があります。これを避けるために、マシンのメーカーは、フォーカスの喪失を防ぐグリッドを備えた特別なタイプの96ウェルプレートを開発しました。
この機械は、画像を撮影しながら熱を発生します。顕微鏡を含むインキュベーターの温度を36.5°Cに下げて、画像をキャプチャするときにデバイスが37°Cに平衡化することが重要です。表面積の小さいプレート(96ウェルプレート)を使用する場合は、追加の熱が発生することを考慮してください。実験に周辺ウェル(最初と最後の行/列)を使用せず、実験ウェルの周囲のウェルを他の液体(滅菌PBS)で最大限に充填することを検討し、通気性テープを使用して媒体の蒸発損失を減らします。エッジ効果を最小限に抑えるために調査できるプレートが販売されています12。しかし、前述の方法により、推奨される互換性のあるマイクロプレートの使用が可能になった。
ビデオを分析するとき、研究者はコロニーからの異常な分裂パターンを認識する必要があります。たとえば、ビュー内に 10 日間分割がなく、視野の端からコロニー形成が横行している場合、新しいコロニーの最初の分割である可能性は低いです。周囲の視野から成長するコロニーが、新しいコロニーではなく、捕獲されたプレートの部分に侵入した可能性があります。これは、ソフトウェアスイートにログインすることで確認できます。ソフトウェアスイートでは、特定の時点でのプレート全体(記録されたすべてのビューを含む)を描写し、ある視野から別の視野への細胞の移動を示すことができます。
この方法の主な制限は、その労働集約的な性質です。また、第5世代以降の細胞分裂を追跡することは困難であり、何時間もの作業が必要であり、ビデオを見直して、何がいつ分裂しているのかを正確に捉える必要があります。複数のディープラーニング自動細胞追跡アルゴリズムが開発されており、今後数年間で純粋にAIベースの分析が行われることになります7,13,14。それまでは、このプロトコルで詳述されているような手動追跡は、系統データを開発するための実行可能な方法です。
何一つ。
この研究は、米国(U.S.) の Merit Review Award Number I01 CX001816 の支援を受けました。退役軍人省臨床科学研究開発(CSRD)サービス。内容は、米国退役軍人省または米国政府の見解を表すものではありません。実験を行うために彼のタイムラプス顕微鏡へのアクセスを提供してくれたマイケル・ローゼンブラム博士に感謝します。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
96 Well Imagelock plate | Sartorius | BA-04856 | Suggested microplate compatible with machine if using a 96 well plate. |
24 well plate | Corning | 3524 | Suggested microplate compatible with machine if using a 24 well plate. |
Amphotericin B, 50 mL | Corning | 30-003-CF | Dilute to 5x (comes in 100x stock) for 5x PSA - 1x for media changes |
Epilife, 50 mL | Gibco | MEP1500CA | Add S7, consider primocin |
IncuCyte S3 | Sartorius | 4637 | Imager (Zoom/SX5 acceptable alternatives) |
Penicillin/Streptomycin, 100 mL | Corning | 30-002-Cl | Dilute to 5x (comes in 100x stock) |
Primocin | Invivogen | ant-pm-05 | 1 mL per 500 mL media |
Supplement S7 | Gibco | S0175 | Added to epilife |
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