表皮ケラチノサイト増殖動態を研究するためのタイムラプス写真によるライブセルイメージング

ここでは、継代0のケラチノサイトの系統を手動で追跡するために使用できるライブセルイメージング解析の方法を提供し、細胞分裂の運命や細胞周期の持続時間などの増殖指標を収集できるようにします。

生細胞イメージングは、 in vitroでケラチノサイトの挙動を研究するための進化途上の、やや挑戦的な方法です。歴史的に、ケラチノサイトの分裂挙動は、クローン解析、免疫染色、細胞周期解析などの方法によって研究されてきました。これらの方法のいずれも、単一細胞レベルでのケラチノサイトの挙動をリアルタイムで解析することはできません。過去10年間、グループはライブセルイメージングを利用して、標識を必要とせずにケラチノサイト幹細胞とコミットされた前駆細胞を同定してきました。それぞれのグループの分裂挙動、終末分化の速度、および細胞周期の持続時間に違いが特定されています。ここでは、タイムラプス撮影によるケラチノサイト生細胞イメージングの方法とその解析方法について説明する。この方法では、イン ビボ の挙動を最も忠実に模倣するために、未継代のケラチノサイトを利用することが推奨されます。ライブセルイメージングは、幹細胞とコミットされた前駆細胞の挙動をシングルセルレベルで研究し、分裂運命、細胞周期の持続時間、およびその他の増殖指標を決定する独自の機能を提供します。

細胞集団が長期間にわたって拡大する様子を in vitro でリアルタイムに可視化できることは、生細胞イメージングのユニークな利点です。ライブセルイメージングでは、細胞の運動性、遊走、増殖をシングルセルレベルで評価することができます。このプロトコルの目標は、タイムラプス写真によるケラチノサイト培養の視覚化を最適化し、手動で追跡して細胞の挙動に関する詳細なデータを取得できるビデオを作成することです。

私たちの焦点は増殖速度論にあります。ライブセルイメージングビデオの解析から、系統樹を解明し、分裂間の時間(細胞周期の持続時間の代理)や、娘細胞のさらなる分裂と分化につながる分裂の割合を評価することができます。

初代ケラチノサイトを扱う際には、ドナー間のばらつきが大きく、細胞増殖の試みが頻繁に失敗する。このため、多くの研究者は、HaCaT細胞や新生児ケラチノサイトなどの増殖性の高いケラチノサイトを使用すること^{を選択します。}成人または老化した皮膚から初代ケラチノサイトを培養し、系統追跡を行うことは困難な場合があります。しかし、細胞株や男性の包皮由来の継代細胞の使用には問題があります。継代を繰り返すと、in vivoの状態とは大きく異なる細胞が得られます²。さらに、HaCaT細胞は、複数のアッセイで初代ケラチノサイトとは異なる反応を示すことが示されています^3,4,5。in vivoの対応物に最も近い細胞を利用するために、成人のヒトドナーからの継代0ケラチノサイトが利用されます。ケラチノサイト幹細胞とコミットされた前駆細胞は、挙動に明確な違いを示し、これにより、ライブ^{セルイメージング6}を介していずれかの集団のコロニーを区別することができます。この比較的新しい能力は、単一ケラチノサイトの長期にわたる挙動を視覚化するもので、同様の技術を用いた以前のいくつかの研究でしか使用されていませんでした^6,7,8。このプロトコールでは、IncuCyte S3 Live-Cell Analysis Systemを用いた初代ケラチノサイトのライブセルイメージングについて概説します。構築された系統樹から、コロニーのタイプ(幹細胞とコミットされた祖先)、細胞周期の期間、分化分裂の割合を判断できます。

この研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。すべてのヒト組織は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)の治験審査委員会(IRB)の承認後に取得され、使用されたすべての組織について同意が得られました。

1.通過0人のヒトケラチノサイトのタイムラプス撮影

注:このプロトコルは、IncuCyte S3およびSX5に特有のものです。

1. 研究にヒト組織を使用するために、機関のヒト研究委員会から適切な承認が得られていることを確認してください。
2. 前述のように、新鮮な肌からケラチノサイトを単離します⁹。
3. アッセイの播種密度を決定します。異なるドナーからの複数の希釈液のサンプルを使用してパイロット研究を実施し、研究に十分なコロニーを確保しながら、観察期間中にコロニーが重複する過剰なコロニーを防ぐために必要な細胞密度を理解します。これらのパイロットは、同じ実験条件(同じプレート、試薬など)で実行してください。これらの要因によって結果が変わる可能性があるためです。
   注:播種密度が低すぎると成長が不十分になり、播種密度が高すぎると、フィールド内の細胞が密集しているため、細胞を正確に追跡できなくなります。
   1. コレクション培地に4°Cで保存されたコレクションから48時間未満の新生児包皮からの継代0ケラチノサイトの場合、播種密度が1000-5000 / cm²であることを確認してください。P1ケラチノサイトの場合、500-2000細胞/ cm²を使用します。通路が遠いほど、播種密度は低くなります。
4. 選択したプレート サイズのプレート セル。
   注:96ウェルプレートとマイクロプレートにはメニスカス効果があり、細胞分布が不均一になり、成長の大部分がイメージャーのフィールド外にあります。より大きなウェルを持つプレート(たとえば、24ウェルプレート)では、より多くのデータをキャプチャできます。24ウェルプレートで最大36個のフィールドを視覚化できますが、96ウェルプレートでは最大5個のフィールドのみを視覚化できます。ただし、機器でキャプチャされるフィールドの数には限りがあり、フィールドが増えるとイメージャの容量がより多く消費されます。通常、24ウェルプレートが使用されます。
   1. プレート上の細胞の均一な分布を達成するために、さまざまな手法を使用することができます。まず、各ウェルを個別に播種するのではなく、特定の希釈ですべてのウェルに必要な全培地をマイクロチューブに分注します。次に、アリコートが目的の密度に達するために必要な細胞の総数をピペットで取り、チューブを穏やかに反転させて細胞を均一に分布させます。
   2. めっき後、プレートをクロスパターンで3回(上下左右)動かし、慎重にインキュベーターに移します。
      注意:マイクロプレートを使用する場合は、タイムラプス顕微鏡がイメージング時に熱を発生し、それらのウェル内の媒体が蒸発する可能性があるため、ウェルの外側の行と列は避けてください。実験用ウェルは、プレートの中央にグループ化し、蒸発/エッジ効果を減らすために、PBSまたはその他の滅菌流体を最大容量で含むウェルで囲む必要があります。
5. 細胞を37°Cおよび5%CO₂ で24時間インキュベートし、接着可能にします。
6. 24時間後にメディアを交換します。
   注意: 吸引するときは、成長している単層を邪魔しないでください。常に温めた培地(37°C)を使用し、側壁を使用して培地をウェルに穏やかに流します。ここで使用している培地は、エピライフ/サプリメントS7/プリモシンです。このアプリケーションには、長期の生細胞イメージングのための培地中の抗生物質の使用が推奨されます。複数の同時実験に使用される機械での長期培養は、汚染のリスクが高くなります。ペニシリンとストレプトマイシンが一般的に使用されます。
7. 左下の大きな三角形のボタンを押してインキュベーターを開き、ライトが緑色のときにトレイを開きます。船を開いた湾に置きます。次に、左下にある同じボタンを使用してトレイを閉じます。開くボタンが赤のときは、トレイがアクティブにスキャン中であり、スキャンが中断されるため、トレイを開かないでください。
   注意: スキャンが行われていないことを確認するには、コントローラモジュールの画面を見てください。次のスキャンまでの時間とスキャンの長さを示します。スキャンが開始されている場合は、スキャンが完了するまでの時間が与えられます。
8. コンピュータでアプリケーションを開き、適切なユーザIDとパスワードを使用してログインします。 [スケジュール] を選択します。
9. スケジュールの下の左上隅にある + ボタンを押して、プレートをスケジュールに追加します。
10. 「スケジュールに従ってスキャン」を選択し、「次へ」をクリックします。
11. [ 新規] を選択し、[ 次へ] をクリックします。
    注:このプレートが以前の実験または実行中の実験と同一である場合は、「 Copy Previous 」または 「Copy Current 」を使用して実験のフォーマットを迅速化できます。
12. スキャンの種類として [標準 ] を選択し、[ 次へ] をクリックします。
    注:Image Lockは、ピントの喪失/画像のジャンプの発生を最小限に抑えるのに役立つ独自の96ウェルプレートであり、これらの問題に直面した場合に役立ちます。他のスキャン・タイプは、リネージ・トレーシングには特に役立ちません。
13. スキャン設定については、「 Adherent Cell-by-Cell using the phase channel at 10x Objective」を選択し、「 Next」をクリックします。
    注:フェーズチャネルが選択されている限り、データがキャプチャされた後に分析を開始できるため、この時点で分析オプションを選択する必要はありません。
14. 船舶を選択し、[ 次へ]をクリックします。最も一般的な容器は装置と互換性がありますが、マイクロプレート以外のものは、タイムラプス顕微鏡のベイに収まるように特別なアタッチメントが必要になる場合があります。
15. 空いているベイを選択して船舶を配置し、[ 次へ]をクリックします。
16. スキャンするウェルとウェルごとの画像を選択し、[ 次へ] をクリックします。推定スキャン時間は、画面の左下に表示されます。
17. 目的の名前付け規則を使用して実験に名前を付けます。後で参照できるように実験のプレートマップを作成し、[ OK]をクリックします。最後に、[ 次へ] をクリックします。
18. スキャンが完了した後にセルごとの分析を開始する必要があるため、データ収集後まで分析を延期します。 「次へ」をクリックします。
19. 最後に、イメージングの頻度を設定します。30分以上発生する有糸分裂を確実に追跡するには、ケラチノサイトを20分間隔でスキャンします。 [次へ ] を押して設定を確認し、実験を開始します。
    注意: スキャン時間が重複することはできず、製造元は、スキャンしている限りマシンを静止させることを推奨しています。20分間隔の場合、最大10分をスキャンに費やす必要があります。24ウェルプレートの12ウェルをウェルあたり36ビューで画像化する場合、スキャンが完了するまでに7分かかるため、計画を立てる際には、実験に利用可能なリソースに常に注意する必要があります。
    1. 機械を休ませる時間が不十分な場合、およびスキャン時間が重なる場合は船舶をスケジュールに追加できない場合は通知されます。船舶が定期的にスケジュールに収まらない場合は、「 トレイの予約場所 」をクリックして 「次へ」をクリックします。
    2. 画面上部のスケジュールをダブルクリックし、予備の船舶を選択してから、手動でクリックして空いている時間枠に画像を追加します。または、スケジュールが開いたら右クリックしてスケジュールされたすべてのスキャン時間を削除し、右クリックしてスキャン・グループの新しいスキャン時間を定期的に設定します。
       注:これにより、新しい時間が設定されるまで、マシン上のすべての実験が中断されます。フロッピーディスクのアイコンをクリックして保存するか、赤いXを押してスケジュールの変更をキャンセルすることを忘れないでください。目的のウェルまたはビューの選択は、パラメータの選択時にマシンがすぐに推定スキャン時間を提供するため、簡単なプロセスです。スキャン時間は、選択したプレートの種類とブランド、およびスキャンするウェルまたはビューの数によって異なります。これにより、ユーザーはマシンの容量に合わせてスキャンパラメータを調整できます。
20. ケラチノサイトの場合は、48時間ごとに培地を交換します。プレートの向きが正しいことを確認するには、容器を機械に入れるたびに最初のスキャンが完了するのを待ちます(時間が許せば)。それは単純な間違いです。プレートを機械にセットして、列を示す文字がベイの左側にくるようにします。
    1. スキャンを表示するには、目のアイコンが付いた [表示] ボタンを押してから、実験をダブルクリックします。培地の色が急激に変化した場合(酸性化によりフェノールレッドを含む培地が黄色になる)、過剰な死細胞が存在する場合(生きたコロニーの増殖を妨げる可能性がある)、または異常な形態が観察された場合は、培地の早期交換を検討してください。
21. すべてのウェルが静止状態になるか、合流点に達したら、実験をエクスポートします。成虫のコロニーを~2週間、新生児を~10日間追跡しますが、その時点で混雑により分析のリターンが減少します。
22. エクスポートするには、[ 表示 ] タブをクリックし、最近のスキャンのリストの下にある実験をダブルクリックします (デフォルトでは、最新の逆順に並べられます)。矢印の付いた ランドスケープ アイコンをクリックし、エクスポートツールが起動するのを待ちます。
23. 「表示通り」をクリックし、「次へ」をクリックします。
24. エクスポートする各ビューフィールドを手動でクリックし、[ 次へ]をクリックします。
25. ムービーまたは一連の画像のどちらが必要かを選択し、エクスポートするスキャン時間を選択します。ケラチノサイト系統のトレースでは、ムービーオプションを使用してすべてのスキャンを選択します(これを迅速に行うために、破線付きのクイックすべて 選択 アイコンがあります)。 「次へ」をクリックします。
26. 最高品質で1秒あたり1フレームでエクスポートします(品質の横にあるバーを使用して設定します)。 「次へ」をクリックします。
27. ターゲットフォルダとファイルタイプを選択します。ファイルに名前を付けて、[ エクスポート] をクリックします。
    注:インターネット接続の速度や関係するコンピューターによっては、ビデオのエクスポートに時間がかかる場合があります。大規模な実験のためにすべてのビデオファイルをエクスポートするには、数日待つことを覚悟してください。タイムラプス顕微鏡にリモートでログインできる機能は非常に便利です。

2. タイムラプスイメージングによる系統樹の構築とデータシートの生成

1. メディアプレーヤーを使用してビデオファイルを開きます。VLCメディアプレーヤーをお勧めします。
2. ビデオをスクロールして、成長しているコロニーを特定します。VLCでは、矢印キーを使用してフレームを前後にスキップします。追跡するコロニーのスクリーンショットを撮り、コロニーにラベルを付けます。
3. ビデオ録画の終了時または数日後に目的のコロニーを特定し、ビデオを巻き戻してコロニー形成細胞を特定します。
   注:これは、適切な播種密度を持つことが重要な場所です。隣り合って発生するコロニーが多すぎると、コロニーが拡大して互いに融合し、細胞分裂を正確に追跡できなくなります。
4. セルが分裂しようとしているとき、セルは凝縮しているように見えます(図1)。分割が発生したら、ビデオを一時停止します。除算の時間を記録します (タイムスタンプは左下隅にあります)。この最初の分割のスクリーンショットを撮り、コロニーと同じラベルを付けます。手描きの系統図に分割を記録します(代表的な結果を参照)。できるだけ多くの世代を追跡し、文書化し続けます。
   注:このプロセスを迅速化し、細胞をより正確に追跡するために、自動細胞追跡が開発されています/開発されています⁷。低カルシウム培養条件でも、分化が最小限に抑えられている機械学習モデルでは、ケラチノサイトの分裂を正確に追跡する感度が不足しているのが現状です。
5. 手動系統ツリーをデータシートに転記します - スプレッドシートの色にちなんで「グリーンシート」と名付けられました(補足ファイル1)。
6. グリーンシートを使用して、増殖分裂と分化分裂の割合を計算し、幹細胞とコミットされた前駆細胞コロニー、および細胞周期の持続時間を特定します(代表的な結果を参照)。
   注:このマシンは、独自の基本分析装置および細胞ごとの分析装置を介してデータを分析し、他の複数のアッセイ(コンフルエンス、スクラッチ)を実行することができます。ただし、これはこのプロトコルの範囲を超えています。

初代ケラチノサイトは常同型的に増殖し、ライブセルイメージングで追跡することができます。VLCメディアプレーヤーは、録音の調査に使用されます。最初の分裂までの時間は変動し、年齢、健康状態、 in vitro 環境に存在する成長因子など、ドナーの特性に応じて数日になる場合があります。最初の播種時には、ケラチノサイトは小さく丸みを帯びた外観をしています(図1)。播種後、コロニー形成ケラチノサイトは通常、平らになります(図1)。これらの平坦化されたケラチノサイトは、分裂していないケラチノサイトよりも移動性が高い傾向があります(補足ビデオ1)。分裂する直前に、扁平になったケラチノサイトが中央で凝縮しているように見えます(図1)。

最初の分裂を除いて、分裂する(増殖性-P)ケラチノサイトの95%は、前の分裂から48時間以内に分裂します⁶。そうでないものは、最終分化型(D)(図1)⁶と見なされます。これらの分化した細胞は、観察期間が終了するまで、またはプレートから浮き上がり、その後の培地交換で除去されるまで、接着したままになります。分化した細胞は時間の経過とともに増殖する傾向があり、その結果、ケラチノサイトコロニーの形態が不均一になります(図1)。観察期間が終了したらビデオをエクスポートし、解析を開始します(図2)。

コロニーは、標準化されたプロセスを使用して文書化されます。コロニーが位置していたビデオプレフィックス(A1、A2...、B1、B2...)が使用され、その後にコロニー番号が続きます。たとえば、A2-6 はビデオ A2、コロニー 6 になります。分析は、系統トレースから始まります。ビデオの最後まで早送りしてコロニーを特定し、観察期間の最初に巻き戻して元のコロニー形成細胞を特定します。すべてのディビジョンのタイムスタンプを発生時に追跡し、手作業で分岐図を作成して、可能な限り多くの世代を正確に追跡します(図3)。最終的には、細胞密度のために細胞分裂を正確に追跡することは不可能になります(これは通常、コロニーが幹細胞に由来するか、コミットされた前駆細胞に由来するかによって異なりますが、第5世代から第7世代頃に発生します)。後の世代では、コロニーが別のコロニーと合流したり、コロニーが画面から消えたりすることがよくあります。この時点で、最後の追跡可能なセルを U (追跡不能) としてマークします。追跡されているコロニーのスクリーンショットを常に撮り(これはVLCのスナップショット機能を使用して実行できます)、上記の命名法を使用してコロニーをマークします。スクリーンショットには、分析した特定のビデオやスクリーンショットに一致させることができるコロニー番号など、標準化された命名法でラベルを付けてください。

分岐図が構築できたら、スプレッドシートまたは「グリーンシート」(補足ファイル1)にデータを転送できます。緑色のシートには、ブランチダイアグラムで追跡された各コロニーに同じラベルが含まれています。世代を簡単に識別できるように、色のハイライトは世代間で交互に使用されています。第1世代のタイム1は、細胞をプレーティングしてからタイムラプス顕微鏡にセットするまでの期間を指します。補足ファイル1では、第1世代のうち時間1は、めっき後24時間後にセルを機械上に置くため、24時間である。時間 2 は、セルが最初の分裂を経るまでの期間を表します。ビデオのタイムスタンプは追加の 24 時間を考慮していないため、各世代で時間を手動で追加する必要があることを思い出してください。分岐図からグリーンシートにデータを転記するときは、マシンが提供するタイムスタンプが記録開始前の時間を考慮していないため、分割の時間に常に24時間を追加してください。ΔTは細胞周期の持続時間です。ほとんどの研究^6,8では、第1世代のΔTは、常に後続世代のΔTよりもはるかに長く、非常に変動するため、分析に偏りが生じるため、分析に含めていません。

グリーンシートが構築されると、どのコロニーが幹細胞に由来し、どのコロニーがコミットされた祖先に由来するかを判断できます。主に増殖性分裂を示し(図1)、観察期間の終わりまで持続するコロニーは、幹細胞^{コロニー6}と見なされます。観察期間中に最終的に分化したコロニー(図1)は、コミットされた祖先コロニー6^{と見なされます。}次に、幹細胞コロニーとコミットされた前駆コロニーの平均ΔTをそれぞれ計算できます。D分裂の割合を総分裂で割ることにより、幹細胞/コミットされた前駆コロニーのすべてのプール分裂について、それぞれ、または世代ごとに、分化分裂の割合を計算できます。グリーンシートは、データを整理して効率的に情報を取得するための便利な方法であり、研究の目標に必要なデータと統計に応じて進化します。

図1:細胞分裂と分裂用語に至るまでのケラチノサイトの形態の変化。 ケラチノサイトは、細胞分裂に至るまでの形態学的変化のステレオタイプなシーケンスを通じて進行します。この図は、時間の経過とともにこの一連のイベントを受けているケラチノサイトを示しています。分裂しようとしている個々の細胞は運動性があり、最初は平らな形態をとり、分裂の直前に中央に凝縮します。増殖を続ける娘細胞は、生成されてから48時間以内に分裂し、そうでなければ末端分化していると見なされます。スケールバー400μm。BioRenderで作成。Ghadially、R.(2025)https://BioRender.com/k40e714 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:タイムラプス顕微鏡からのデータのエクスポート。マシンからデータをエクスポートする方法に関するガイド。BioRenderで作成。Ghadially, R. (2024) BioRender.com/x99d452 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.グリーンシートの作成を通知するための前駆枝図(系統樹)。 系統樹の例で、通常は手描きです。略語:h:時間、m:分。BioRenderで作成。Ghadially, R. (2025) https://BioRender.com/wbt7z8x この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1。未発表のライブセルイメージングデータの例(緑色のシート)。未公開データを含むグリーンシートの例。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ1。ケラチノサイトライブセルイメージングビデオの例。 ケラチノサイトのコロニーを追跡するのに適した細胞密度のライブセルイメージングビデオ このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ケラチノサイトのライブセルイメージングは、幹細胞とコミットされた前駆細胞の分裂挙動を追跡するためのラベルフリーの方法です。表皮の維持が幹細胞とコミットされた前駆細胞の増殖動態に依存していることを考えると¹⁰、これらのケラチノサイト集団の変化とそれらがさまざまな条件でどのように影響を受けるかを詳細に理解することは、発見された欠陥を改善するための治療法の開発を促進します。

最終的に、ライブセルイメージングによる系統追跡は、使用可能なデータを取得することにかかっています。コロニー形成ユニットは、タイムラプス写真によって生成されたビデオではっきりと見える必要があります。新たに分離された継代0細胞では、真のクローン密度を得ることは困難です。めっきされたケラチノサイトのわずか3%〜4%が最終的にコロニーを形成します¹¹。細胞が多すぎると、分裂を追跡したり、最初のコロニー形成細胞を特定したりすることができなくなる可能性があります。細胞が少なすぎると、コロニーが形成されない可能性があります。同様に、視野を覆い隠すものはすべて、系統追跡によって細胞を追跡することを不可能にします。線維芽細胞フィーダーを使用すると、線維芽細胞が視野を覆い隠すため、分裂の追跡が困難になる場合があります。同様に、沈殿物、細胞の破片、さらにはプレートの蓋の結露でさえ、成長するコロニーを覆い隠す可能性があります。マイクロプレートが選択したベイにしっかりと挿入されていることを確認しないなどの小さなことでも、画像が細胞に焦点を合わせないため、最終的には実験が失敗する可能性があります。そのため、コロニーがマシン内で成長している間、コロニーを毎日監視し、最初のスキャン後、つまりマイクロプレートをメディア交換のためにマシンから取り外すたびに、常に滞在して、細胞がタイムラプス写真によってキャプチャされていることを確認することが非常に重要です。破片が引き起こす可能性のある別の問題は、画像のジャンプです。通常、顕微鏡は動かない固定視野を持っていますが、破片が蓄積したり、細胞密度が高くなりすぎると、機械は視野を失い、プレートの別の部分にジャンプする可能性があります。これを避けるために、マシンのメーカーは、フォーカスの喪失を防ぐグリッドを備えた特別なタイプの96ウェルプレートを開発しました。

この機械は、画像を撮影しながら熱を発生します。顕微鏡を含むインキュベーターの温度を36.5°Cに下げて、画像をキャプチャするときにデバイスが37°Cに平衡化することが重要です。表面積の小さいプレート(96ウェルプレート)を使用する場合は、追加の熱が発生することを考慮してください。実験に周辺ウェル(最初と最後の行/列)を使用せず、実験ウェルの周囲のウェルを他の液体(滅菌PBS)で最大限に充填することを検討し、通気性テープを使用して媒体の蒸発損失を減らします。エッジ効果を最小限に抑えるために調査できるプレートが販売されています¹²。しかし、前述の方法により、推奨される互換性のあるマイクロプレートの使用が可能になった。

ビデオを分析するとき、研究者はコロニーからの異常な分裂パターンを認識する必要があります。たとえば、ビュー内に 10 日間分割がなく、視野の端からコロニー形成が横行している場合、新しいコロニーの最初の分割である可能性は低いです。周囲の視野から成長するコロニーが、新しいコロニーではなく、捕獲されたプレートの部分に侵入した可能性があります。これは、ソフトウェアスイートにログインすることで確認できます。ソフトウェアスイートでは、特定の時点でのプレート全体(記録されたすべてのビューを含む)を描写し、ある視野から別の視野への細胞の移動を示すことができます。

この方法の主な制限は、その労働集約的な性質です。また、第^{5世代以降の}細胞分裂を追跡することは困難であり、何時間もの作業が必要であり、ビデオを見直して、何がいつ分裂しているのかを正確に捉える必要があります。複数のディープラーニング自動細胞追跡アルゴリズムが開発されており、今後数年間で純粋にAIベースの分析が行われることになります^7,13,14。それまでは、このプロトコルで詳述されているような手動追跡は、系統データを開発するための実行可能な方法です。

何一つ。

この研究は、米国(U.S.) の Merit Review Award Number I01 CX001816 の支援を受けました。退役軍人省臨床科学研究開発(CSRD)サービス。内容は、米国退役軍人省または米国政府の見解を表すものではありません。実験を行うために彼のタイムラプス顕微鏡へのアクセスを提供してくれたマイケル・ローゼンブラム博士に感謝します。