Imaging di cellule vive con fotografia time lapse per studiare la cinetica di proliferazione dei cheratinociti epidermici

Qui, forniamo un metodo per l'analisi dell'imaging di cellule vive che può essere utilizzato per tracciare manualmente i lignaggi dei cheratinociti di passaggio 0 e che consente la raccolta di metriche di proliferazione, tra cui il destino della divisione cellulare e la durata del ciclo cellulare.

L'imaging di cellule vive è un metodo in evoluzione e alquanto impegnativo per studiare il comportamento dei cheratinociti in vitro. Storicamente, il comportamento di divisione dei cheratinociti è stato studiato attraverso metodi come l'analisi clonale, l'immunocolorazione e l'analisi del ciclo cellulare. Nessuno di questi metodi consente l'analisi del comportamento dei cheratinociti a livello di singola cellula in tempo reale. Nell'ultimo decennio, i gruppi hanno utilizzato l'imaging di cellule vive per identificare le cellule staminali dei cheratinociti e i progenitori impegnati senza la necessità di etichettatura. Sono state identificate differenze nel comportamento di divisione di ciascun gruppo, nel tasso di differenziazione terminale e nella durata del ciclo cellulare. Qui viene descritto un metodo per l'imaging di cellule vive di cheratinociti con fotografia time-lapse e la sua analisi. Si raccomanda l'utilizzo di cheratinociti non attraversati affinché questo metodo imiti il comportamento in vivo il più fedelmente. L'imaging di cellule vive offre una capacità unica di studiare il comportamento delle cellule staminali e dei progenitori impegnati a livello di singola cellula e di determinare i destini di divisione, la durata del ciclo cellulare e altre metriche di proliferazione.

La capacità di visualizzare le popolazioni cellulari in vitro in tempo reale mentre si espandono per lunghi periodi di tempo è un vantaggio unico dell'imaging su cellule vive. L'imaging di cellule vive consente di valutare la motilità, la migrazione e la proliferazione cellulare a livello di singola cellula. L'obiettivo di questo protocollo è quello di ottimizzare la visualizzazione delle colture di cheratinociti tramite fotografia time-lapse, producendo video che possono poi essere tracciati manualmente per ottenere dati granulari sul comportamento cellulare.

La nostra attenzione è rivolta alla cinetica di proliferazione. Dall'analisi dei video di imaging delle cellule vive, è possibile chiarire gli alberi di lignaggio e valutare il tempo tra le divisioni (un proxy per la durata del ciclo cellulare), nonché le proporzioni delle divisioni che portano a un'ulteriore divisione rispetto alla differenziazione delle cellule figlie.

C'è una sostanziale variabilità da donatore a donatore quando si ha a che fare con cheratinociti primari e frequenti tentativi falliti di propagazione cellulare. Per questo motivo, molti ricercatori scelgono di utilizzare cheratinociti altamente proliferativi come le cellule HaCaT o i cheratinociti neonatali, spesso dopo aver subito più passaggi in vitro¹. La coltura di cheratinociti primari da pelle adulta o invecchiata ai fini del tracciamento del lignaggio può essere impegnativa. Tuttavia, ci sono problemi con l'uso di cellule passate da linee cellulari o dal prepuzio maschile. Il passaggio ripetuto produce cellule che sono significativamente diverse dal loro stato in vivo ². Inoltre, è stato dimostrato che le cellule HaCaT reagiscono in modo diverso rispetto ai cheratinociti primari in più saggi ^3,4,5. Per utilizzare le cellule che più assomigliano alle loro controparti in vivo, vengono utilizzati cheratinociti di passaggio 0 da donatori umani adulti. Le cellule staminali dei cheratinociti e i progenitori impegnati mostrano differenze di comportamento distinte, che consentono di distinguere le colonie di entrambe le popolazioni tramite l'imaging di cellule vive⁶. Questa capacità relativamente nuova di visualizzare il comportamento dei singoli cheratinociti a lungo termine è stata utilizzata solo in pochi studi precedenti utilizzando tecniche simili ^6,7,8. Questo protocollo delinea l'imaging di cellule vive di cheratinociti primari utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive IncuCyte S3. Dagli alberi di lignaggio che vengono costruiti, è possibile determinare il tipo di colonia (cellula staminale contro progenitore impegnato), così come la durata del ciclo cellulare e la proporzione delle divisioni di differenziazione.

Questo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Tutti i tessuti umani sono stati ottenuti dopo l'approvazione da parte del comitato di revisione istituzionale (IRB) dell'Università della California, San Francisco (UCSF) e il consenso è stato ottenuto per tutti i tessuti utilizzati.

1. Fotografia time lapse del passaggio 0 cheratinociti umani

NOTA: questo protocollo è specifico per IncuCyte S3 e SX5.

1. Assicurarsi che siano state ottenute le approvazioni appropriate dal comitato di ricerca umana dell'istituto per utilizzare il tessuto umano per lo studio.
2. Isolare i cheratinociti dalla pelle fresca come descritto in precedenza⁹.
3. Determinare la densità di semina per il saggio. Eseguire studi pilota con campioni a diluizioni multiple da diversi donatori per comprendere la densità di cellule necessarie al fine di garantire colonie adeguate per lo studio, ma prevenire colonie eccessive che provocano la sovrapposizione delle colonie durante il periodo di osservazione. Esegui questi progetti pilota in condizioni sperimentali identiche (stesse piastre, reagenti, ecc.), poiché questi fattori possono alterare i risultati.
   NOTA: Una densità di semina troppo bassa comporta una crescita insufficiente, mentre una densità di semina troppo alta comporta l'incapacità di tracciare con precisione le cellule a causa dell'affollamento delle cellule nel campo.
   1. Per i cheratinociti di passaggio 0 da prepuzi neonatali di età inferiore a 48 ore provenienti da una raccolta conservata a 4 °C in terreni di raccolta, assicurarsi che la densità di semina sia di 1000-5000/cm². Per i cheratinociti P1, utilizzare 500-2000 cellule/cm². Più lontano è il passaggio, minore è la densità di semina.
4. Celle della piastra sulla dimensione della piastra selezionata.
   NOTA: Le piastre e le micropiastre a 96 pozzetti hanno un effetto menisco, con conseguente distribuzione cellulare non uniforme, con gran parte della crescita al di fuori del campo dell'imager. Le piastre con pozzetti più grandi (ad esempio piastre da 24 pozzetti) consentono di acquisire più dati. Le piastre a 24 pozzetti consentono la visualizzazione di un massimo di 36 campi, mentre le piastre a 96 pozzetti consentono la visualizzazione di un massimo di 5 campi. Tuttavia, il numero di campi acquisiti su uno strumento è limitato e più campi utilizzeranno una parte maggiore della capacità dell'imager. In genere, viene utilizzata una piastra a 24 pozzetti.
   1. Per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule sulla piastra possono essere utilizzate varie tecniche. Innanzitutto, invece di seminare singolarmente ogni pozzetto, aliquotare il terreno totale necessario per tutti i pozzetti a una diluizione specifica in una microprovetta. Quindi, pipettare il numero totale di cellule necessarie affinché l'aliquota raggiunga la densità desiderata e capovolgere delicatamente la provetta per distribuire le cellule in modo omogeneo.
   2. Dopo la placcatura, spostare la piastra a croce tre volte (su-giù, sinistra-destra) e poi trasferirla con cautela nell'incubatrice.
      ATTENZIONE: Se si utilizza una micropiastra, evitare le file e le colonne esterne dei pozzetti, poiché il microscopio time-lapse genera calore durante l'imaging e può causare l'evaporazione dei mezzi in tali pozzetti. I pozzetti sperimentali devono essere raggruppati al centro della piastra e circondati da pozzetti contenenti PBS o altro fluido sterile alla massima capacità per ridurre gli effetti di evaporazione/bordo.
5. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C e 5% di CO₂ per consentire l'aderenza.
6. Cambiare i supporti dopo 24 ore.
   NOTA: Non disturbare il monostrato in crescita durante l'aspirazione. Utilizzare sempre fluidi riscaldati (37 °C) e versare delicatamente i fluidi nei pozzetti utilizzando la parete laterale. Il mezzo utilizzato qui è Epilife/Supplemento S7/Primocin. Per questa applicazione si raccomanda l'uso di antibiotici nei terreni per l'imaging a lungo termine di cellule vive. La coltura estesa in una macchina utilizzata per più esperimenti simultanei è ad alto rischio di contaminazione. La penicillina e la streptomicina sono comunemente usate.
7. Aprire l'incubatrice premendo il grande pulsante triangolare in basso a sinistra per aprire il vassoio quando la luce è verde. Metti la nave in una baia aperta. Quindi, chiudi la teglia utilizzando lo stesso pulsante in basso a sinistra. Non aprire mai il vassoio quando il pulsante per l'apertura è rosso, poiché ciò significa che è in corso una scansione attiva e la scansione verrà interrotta.
   ATTENZIONE: Assicurarsi che non ci siano scansioni a partire dall'osservazione dello schermo sul modulo del controller. Indica il tempo fino alla scansione successiva e la lunghezza della scansione. Se la scansione è iniziata, verrà assegnato il tempo necessario al completamento della scansione.
8. Aprire l'applicazione sul computer ed effettuare l'accesso utilizzando l'ID utente e la password appropriati. Seleziona Programma.
9. Premi il pulsante + nell'angolo in alto a sinistra sotto il programma per aggiungere la piastra al programma.
10. Selezionare Scansione su pianificazione, quindi fare clic su Avanti.
11. Seleziona Nuovo, quindi fai clic su Avanti.
    NOTA: Se questa targa è identica a un esperimento precedente o in esecuzione, è possibile utilizzare Copia precedente o Copia corrente per accelerare la formattazione dell'esperimento.
12. Selezionare Standard per il tipo di scansione, quindi fare clic su Avanti.
    NOTA: Image Lock è una piastra proprietaria a 96 pozzetti che aiuta a ridurre al minimo il verificarsi di perdita di messa a fuoco/salto dell'immagine, che può essere utile se si verificano questi problemi. Gli altri tipi di scansione non sono particolarmente utili per il tracciamento della derivazione.
13. Per le impostazioni di scansione, selezionare Aderente cellula per cella utilizzando il canale di fase all'obiettivo 10x, quindi fare clic su Avanti.
    NOTA: Finché si sceglie il canale di fase, a questo punto non è necessario selezionare alcuna opzione di analisi, poiché l'analisi può essere avviata dopo l'acquisizione dei dati.
14. Seleziona l'imbarcazione, quindi fai clic su Avanti. I recipienti più comuni sono compatibili con la macchina, anche se le non micropiastre potrebbero richiedere attacchi speciali per adattarsi agli alloggiamenti del microscopio time-lapse.
15. Selezionare una baia vuota per posizionare l'imbarcazione, quindi fare clic su Avanti.
16. Selezionare i pozzetti da scansionare e le immagini per pozzetto, quindi fare clic su Avanti. La durata stimata della scansione verrà fornita in basso a sinistra dello schermo.
17. Assegna un nome all'esperimento utilizzando la convenzione di denominazione desiderata. Crea una mappa delle piastre dell'esperimento per riferimento futuro, quindi premi Ok. Infine, fai clic su Avanti.
18. Rimandare l'analisi a dopo la raccolta dei dati, poiché l'analisi cella per cella deve essere avviata dopo il completamento della scansione. Fare clic su Avanti.
19. Infine, impostare la frequenza dell'imaging. Al fine di monitorare in modo affidabile le mitosi, che si verificano nell'arco di 30 minuti, eseguire la scansione a intervalli di 20 minuti alla ricerca di cheratinociti. Premere Avanti e confermare le impostazioni per iniziare l'esperimento.
    NOTA: I tempi di scansione non possono sovrapporsi e i produttori consigliano che la macchina rimanga a riposo per tutto il tempo in cui è in fase di scansione. Con intervalli di 20 minuti, ciò significa che è necessario dedicare alla scansione un massimo di 10 minuti. Se vengono riprodotti 12 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti a 36 visualizzazioni per pozzetto, il completamento della scansione richiede 7 minuti, quindi prestare sempre attenzione alle risorse disponibili per l'esperimento durante la pianificazione.
    1. C'è una notifica se c'è un tempo inadeguato per il riposo della macchina e se i tempi di scansione si sovrappongono, la nave non può essere aggiunta alla pianificazione. Se la nave non può rientrare nel programma a intervalli regolari, fare clic su Riserva posizione vassoio e premere Avanti.
    2. Fare doppio clic sul programma nella parte superiore dello schermo e selezionare la nave in riserva, quindi fare clic manualmente per aggiungere immagini nelle fasce orarie aperte. In alternativa, fare clic con il pulsante destro del mouse una volta aperta la pianificazione per eliminare tutti gli orari di controllo pianificati e fare clic con il pulsante destro del mouse per impostare nuovi tempi di controllo per un gruppo di controllo a intervalli regolari.
       NOTA: Questo interromperebbe tutti gli esperimenti attualmente sulla macchina fino a quando non vengono stabiliti nuovi orari. Non dimenticare di premere l'icona del floppy disk per salvare o la X rossa per annullare le modifiche alla pianificazione. La selezione dei pozzetti o delle viste desiderate è un processo semplice, in quanto la macchina fornisce immediatamente il tempo di scansione stimato al momento della selezione dei parametri. La durata della scansione dipende dal tipo e dalla marca della piastra selezionata, nonché dal numero di pozzetti o viste da scansionare. Ciò consente agli utenti di regolare i parametri di scansione in modo che corrispondano alla capacità della macchina.
20. Per i cheratinociti, cambiare il terreno ogni 48 ore. Per garantire il corretto orientamento della lastra, attendere il completamento della prima scansione ogni volta che un recipiente viene inserito nella macchina (tempo permettendo). È un semplice errore da commettere. Posizionare la piastra nella macchina in modo che le lettere che denotano le file si trovino sul lato sinistro della baia.
    1. Per visualizzare le scansioni, premere il pulsante Visualizza con l'icona a forma di occhio , quindi fare doppio clic sull'esperimento. Prendere in considerazione la possibilità di cambiare i terreni in anticipo se si verifica un improvviso cambiamento nel colore dei terreni (i terreni contenenti rosso fenolo diventano gialli a causa dell'acidificazione), se sono presenti cellule morte in eccesso (possono interferire con la proliferazione delle colonie vive) o se si osserva una morfologia anomala.
21. Una volta che tutti i pozzi sono diventati quiescenti o hanno raggiunto la confluenza, esporta l'esperimento. Seguire le colonie adulte per ~2 settimane e quelle neonatali per ~10 giorni, momento in cui l'affollamento provoca una diminuzione dei rendimenti per le analisi.
22. Per eseguire l'esportazione, fare clic sulla scheda Visualizza e fare doppio clic sull'esperimento nell'elenco delle scansioni recenti (per impostazione predefinita, l'ordine a partire dall'ultima analisi è precedente). Fare clic sull'icona Orizzontale con la freccia e attendere l'avvio dello strumento di esportazione.
23. Fare clic su Come visualizzato, quindi fare clic su Avanti.
24. Fare clic manualmente su ciascun campo visivo da esportare, quindi fare clic su Avanti.
25. Selezionare se si desidera un filmato o una serie di immagini, quindi selezionare i tempi di scansione da esportare. Per il tracciamento del lignaggio dei cheratinociti, utilizzare l'opzione film e selezionare tutte le scansioni (c'è una rapida icona Seleziona tutto con una linea tratteggiata per accelerare questa operazione). Fare clic su Avanti.
26. Esporta a 1 fotogramma al secondo con la massima qualità (impostalo utilizzando la barra accanto a qualità). Fare clic su Avanti.
27. Scegli la cartella di destinazione e il tipo di file. Assegna un nome al file e fai clic su Esporta.
    NOTA: L'esportazione dei video può richiedere molto tempo, a seconda della velocità della connessione Internet e del computer coinvolto. Preparati ad attendere più giorni per esportare tutti i file video per esperimenti più grandi. Avere la possibilità di accedere al microscopio time-lapse da remoto è estremamente comodo.

2. Utilizzo dell'imaging time-lapse per costruire alberi di derivazione e generare fogli dati

1. Apri il file video utilizzando un lettore multimediale. Si consiglia il lettore multimediale VLC.
2. Scorri i video e identifica le colonie in crescita. Con VLC, usa il tasto freccia per saltare i fotogrammi avanti e indietro. Fai uno screenshot della colonia da tracciare ed etichetta la colonia.
3. Identificare una colonia di interesse alla fine o dopo alcuni giorni di registrazione video, quindi riavvolgere il video e identificare la cellula che forma la colonia.
   NOTA: È qui che è importante avere la densità di semina appropriata. Se troppe colonie si sviluppano l'una accanto all'altra, si espandono e si fondono l'una nell'altra, rendendo impossibile tracciare con precisione le divisioni cellulari.
4. Quando una cellula sta per dividersi, sembra condensarsi (Figura 1). Metti in pausa il video quando si verifica la divisione. Registra l'ora della divisione (un timestamp si trova nell'angolo in basso a sinistra). Fai uno screenshot di questa divisione iniziale e assegnale la stessa etichetta della colonia. Registra le divisioni in un diagramma di lineage disegnato a mano (vedi Risultati rappresentativi). Continuate a tracciare e documentare il maggior numero possibile di generazioni.
   NOTA: Il tracciamento automatico delle celle è in fase di sviluppo per accelerare questo processo e tracciare in modo più accurato le celle⁷. Anche in condizioni di coltura a basso contenuto di calcio con differenziazione minima, i modelli di apprendimento automatico attualmente non hanno la sensibilità necessaria per tracciare con precisione le divisioni dei cheratinociti.
5. Trascrivi l'albero di derivazione manuale in fogli dati, così chiamati "fogli verdi" a causa del colore nel foglio di calcolo (File supplementare 1).
6. Utilizza i fogli verdi per calcolare le proporzioni delle divisioni proliferative e differenziative, identificare le cellule staminali e le colonie progenitrici impegnate e la durata del ciclo cellulare (vedi risultati rappresentativi).
   NOTA: La macchina è in grado di analizzare i dati tramite i propri analizzatori di base e cellula per cella per eseguire più altri saggi (confluenza, scratch). Tuttavia, questo va oltre l'ambito di questo protocollo.

I cheratinociti primari crescono in modo stereotipato, che può essere monitorato tramite l'imaging di cellule vive. Il lettore multimediale VLC viene utilizzato per rilevare le registrazioni. Il tempo fino alla prima divisione è variabile e può essere di più giorni a seconda delle caratteristiche del donatore, come l'età, lo stato di salute o i fattori di crescita presenti nell'ambiente in vitro . Dopo la semina iniziale, i cheratinociti hanno un aspetto piccolo e arrotondato (Figura 1). Dopo la semina, i cheratinociti che formano colonie diventano tipicamente appiattiti (Figura 1). Questi cheratinociti appiattiti tendono ad essere più mobili rispetto alle loro controparti non in divisione (Video supplementare 1). Immediatamente prima della divisione, il cheratinocita appiattito sembra condensarsi centralmente (Figura 1).

Ad eccezione della divisione iniziale, il 95% dei cheratinociti che vanno a dividersi (proliferativo - P) lo fa entro 48 ore dalla precedente divisione⁶. Quelli che non lo fanno sono considerati differenziati terminali (D) (Figura 1)⁶. Queste cellule differenziate rimangono aderenti fino alla fine del periodo di osservazione o fino a quando non si sollevano dalla piastra e vengono rimosse al successivo cambio del terreno. Le cellule che si differenziano tendono ad espandersi nel tempo, determinando una morfologia non uniforme della colonia di cheratinociti (Figura 1). Esporta i video una volta concluso il periodo di osservazione e inizia l'analisi (Figura 2).

Le colonie sono documentate utilizzando un processo standardizzato. Viene utilizzato il prefisso video in cui si trovava la colonia (A1, A2..., B1, B2...) seguito dal numero della colonia. Ad esempio, A2-6 sarebbe il video A2, colonia 6. L'analisi inizia con il tracciamento del lignaggio. Avanza velocemente fino alla fine di un video per identificare le colonie, quindi torna all'inizio del periodo di osservazione per identificare la cellula originale che forma la colonia. Tieni traccia dei timestamp di tutte le divisioni man mano che si verificano e crea un diagramma ramificato a mano, monitorando il maggior numero possibile di generazioni (Figura 3). Alla fine non è più possibile tracciare con precisione le divisioni cellulari a causa della densità cellulare (questo di solito accade intorno alla generazione 5-7, a seconda che la colonia abbia avuto origine da una cellula staminale rispetto a un progenitore impegnato). Nelle generazioni successive, la colonia spesso si fonde con un'altra colonia, o la colonia esce dallo schermo. A questo punto, contrassegna l'ultima cella tracciabile come U (non rintracciabile). Fai sempre uno screenshot della colonia che viene tracciata (questo può essere fatto utilizzando la funzione snapshot su VLC) e contrassegna la colonia usando la nomenclatura descritta sopra. Assicurati di etichettare lo screenshot con una nomenclatura standardizzata, includendo il video specifico analizzato e il numero di colonia che può essere abbinato allo screenshot.

Una volta costruito il diagramma di derivazione, i dati possono essere trasferiti in un foglio di calcolo o in un "foglio verde" (File supplementare 1). Il foglio verde contiene la stessa etichetta per ogni colonia tracciata tramite diagramma di ramificazione. Per identificare facilmente le generazioni, le evidenziazioni di colore vengono alternate tra le generazioni. Il tempo 1 della generazione 1 si riferisce al periodo che intercorre tra la placcatura delle cellule e il loro posizionamento sul microscopio time-lapse. Nel file supplementare 1, il tempo 1 della generazione 1 è 24 ore, poiché le celle vengono posizionate sulla macchina 24 ore dopo la placcatura. Il tempo 2 rappresenta la durata fino a quando la cellula subisce la sua prima divisione. Ricordiamo che il timestamp nei video non tiene conto delle 24 ore aggiuntive, quindi le ore devono essere aggiunte manualmente in ogni generazione. Quando si trascrivono i dati dallo schema di derivazione al foglio verde, aggiungere sempre 24 ore al tempo delle divisioni poiché la marcatura temporale fornita dalla macchina non tiene conto del tempo prima dell'inizio della registrazione. ΔT è la durata del ciclo cellulare. La maggior parte degli studi ^6,8 non include nelle analisi il ΔT della prima generazione, poiché è sempre molto più lungo di quello delle generazioni successive ed estremamente variabile, con conseguente analisi distorta.

Una volta costruito il foglio verde, si può determinare quali colonie provengono da cellule staminali e quali da progenitori impegnati. Le colonie che mostrano divisioni prevalentemente proliferative (Figura 1) e durano fino alla fine del periodo di osservazione sono considerate colonie di cellule staminali⁶. Le colonie che si differenziano terminalmente (Figura 1) durante il periodo di osservazione sono considerate colonie progenitrici impegnate⁶. È quindi possibile calcolare il ΔT medio delle colonie di cellule staminali e delle colonie progenitrici impegnate, rispettivamente. Dividendo la proporzione delle divisioni D per le divisioni totali, si può calcolare la proporzione delle divisioni di differenziazione, sia con tutte le divisioni aggregate di cellule staminali / colonie progenitrici impegnate, rispettivamente o per generazione. Il foglio verde è un modo utile per organizzare i dati per ottenere informazioni in modo efficiente e si evolve a seconda di quali dati e statistiche sono necessari per gli obiettivi dello studio.

Figura 1: Cambiamenti nella morfologia dei cheratinociti che portano alla divisione cellulare e alla terminologia della divisione. I cheratinociti progrediscono attraverso una sequenza stereotipata di cambiamenti morfologici che portano alla divisione cellulare. Questa figura raffigura un cheratinocita che subisce questa sequenza di eventi nel tempo. Le singole cellule che stanno per dividersi sono mobili e inizialmente assumono una morfologia appiattita e si condensano centralmente immediatamente prima della divisione. Le cellule figlie che continueranno a proliferare si dividono entro 48 ore dalla generazione, altrimenti sono considerate differenziate terminalmente. Barra graduata 400 μm. Creato in BioRender. Ghadially, R. (2025) https://BioRender.com/k40e714 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esportazione dei dati dal microscopio time-lapse. Una guida su come esportare i dati dalla macchina. Creato in BioRender. Ghadially, R. (2024) BioRender.com/x99d452 Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Diagramma di ramificazione precursore (albero del lignaggio) per informare la creazione di fogli verdi. Un esempio di albero di lignaggio, tipicamente disegnato a mano. Abbreviazioni: h: ore, m: min. Creato in BioRender. Ghadially, R. (2025) https://BioRender.com/wbt7z8x Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1. Esempi di schede tecniche (fogli verdi) di dati di imaging di cellule vive non pubblicati. Un esempio di foglio verde contenente dati non pubblicati. Clicca qui per scaricare questo file.

Video supplementare 1. Esempio di video di imaging di cellule vive di cheratinociti. Un video di imaging cellulare dal vivo con densità cellulare adeguata per tracciare le colonie di cheratinociti Fare clic qui per scaricare questo file.

L'imaging di cellule vive dei cheratinociti è un metodo label-free per tracciare il comportamento di divisione delle cellule staminali e dei progenitori impegnati. Dato che il mantenimento dell'epidermide dipende dalla cinetica di proliferazione delle cellule staminali e dei progenitori impegnati¹⁰, avere una comprensione granulare dei cambiamenti in queste popolazioni di cheratinociti e di come sono influenzati in varie condizioni facilita lo sviluppo di terapie per migliorare i difetti che vengono scoperti.

In definitiva, il tracciamento del lignaggio tramite l'imaging di cellule vive dipende dall'ottenimento di dati utilizzabili. Le unità formanti le colonie devono essere chiaramente visibili nei video generati dalla fotografia time-lapse. Con le cellule di passaggio 0 appena isolate, ottenere una vera densità clonale è difficile. Solo il 3%-4% dei cheratinociti placcati forma infine colonie¹¹. Troppe cellule possono rendere impossibile tracciare le divisioni o persino identificare la cellula iniziale che forma la colonia. Troppo poche cellule e le colonie potrebbero non formarsi. Allo stesso modo, tutto ciò che oscura il campo visivo rende impossibile tracciare le cellule tramite il tracciamento del lignaggio. L'uso di alimentatori di fibroblasti può rendere difficile tracciare le divisioni poiché i fibroblasti oscurano il campo visivo. Allo stesso modo, precipitati, detriti cellulari e persino condensa sul coperchio della piastra possono oscurare le colonie in crescita. Anche qualcosa di piccolo come non garantire che la micropiastra sia inserita saldamente nell'alloggiamento selezionato può alla fine portare a un esperimento fallito, poiché l'immagine non sarà focalizzata sulle cellule. Questo è il motivo per cui è molto importante monitorare le colonie ogni giorno mentre crescono nella macchina e rimanere sempre fino a dopo la prima scansione, ogni volta che la micropiastra viene rimossa dalla macchina per i cambi di terreno, per garantire che le cellule vengano catturate dalla fotografia time-lapse. Un altro problema che i detriti possono causare è il salto dell'immagine. In genere, il microscopio ha campi visivi fissi che non si muovono, ma quando i detriti si accumulano o la densità cellulare diventa troppo elevata, la macchina può perdere il suo campo visivo e saltare in una parte diversa della piastra. Per evitare ciò, i produttori della macchina hanno sviluppato un tipo speciale di piastra a 96 pozzetti con una griglia che impedisce la perdita di messa a fuoco.

La macchina genera calore durante l'acquisizione delle immagini. È importante ridurre la temperatura dell'incubatrice contenente il microscopio a 36,5 °C affinché il dispositivo si equilibri a 37 °C durante l'acquisizione delle immagini. Quando si utilizzano piastre con superfici più piccole (piastre a 96 pozzetti), considerare il calore aggiuntivo generato. Non utilizzare i pozzetti periferici per gli esperimenti (prima e ultima riga/colonna) e considerare di riempire al massimo i pozzetti che circondano i pozzetti sperimentali con altri fluidi (PBS sterile) e utilizzare nastro traspirante per ridurre la perdita per evaporazione dei mezzi. Ci sono lastre commercializzate che potrebbero essere studiate per ridurre al minimo gli effetti dei bordi¹². Tuttavia, i metodi sopra citati hanno consentito l'uso di micropiastre compatibili consigliate.

Quando analizzano i video, gli investigatori devono essere consapevoli dei modelli di divisione anormali delle loro colonie. Ad esempio, se non ci sono divisioni all'interno di una vista per 10 giorni e poi c'è una formazione di colonie dilagante che ha origine dal bordo del campo visivo, è improbabile che si tratti della prima divisione di una nuova colonia. È probabile che una colonia in crescita da un campo visivo circostante abbia invaso la porzione della lastra catturata piuttosto che essere una nuova colonia. Questo può essere verificato accedendo alla suite software, che può rappresentare l'intera lastra (contenente tutte le viste registrate) in punti temporali specifici e mostrare la migrazione delle celle da un campo visivo all'altro.

Il limite principale di questo metodo è la sua natura laboriosa. Inoltre, tracciare le divisioni cellulari oltre la^{quinta generazione è} difficile e richiede ore di lavoro, riguardando i video per catturare con precisione cosa si sta dividendo e quando. Sono in fase di sviluppo diversi algoritmi di tracciamento cellulare automatizzato di deep learning, che nei prossimi anni si tradurranno in un'analisi puramente basata sull'intelligenza artificiale ^7,13,14. Fino ad allora, il tracciamento manuale, come descritto in dettaglio in questo protocollo, è un metodo fattibile per sviluppare dati di derivazione.

Nessuno.

Questo lavoro è stato supportato dal Merit Review Award Number I01 CX001816 degli Stati Uniti (U.S.) Servizio di ricerca e sviluppo (CSRD) del Dipartimento per gli affari dei veterani. I contenuti non rappresentano le opinioni del Dipartimento degli Affari dei Veterani degli Stati Uniti o del Governo degli Stati Uniti. Ringraziamo il Dr. Michael Rosenblum per averci fornito l'accesso al suo microscopio time-lapse per condurre i nostri esperimenti.