Регистрация внутренних выпрямляющих токов K⁺ в свежевыделенных гладкомышечных клетках базилярной артерии методом Patch Clamp

Этот протокол описывает быстрый и эффективный метод выделения гладкомышечных клеток из базилярной артерии крысы и регистрации направленных внутрь токов калиевых каналов в этих клетках с использованием техники патч-зажима для целых клеток. Он предлагает новый подход для исследователей, изучающих базилярную артерию и ионные каналы.

Цереброваскулярные заболевания являются распространенным заболеванием среди пожилых людей, и их частота неуклонно растет. Базилярная артерия является важнейшим мозговым сосудом, который снабжает мост, мозжечок, задние отделы мозга и внутреннее ухо. Активность канала калия (К⁺) играет важную роль в определении тонуса сосудов путем регуляции потенциала клеточной мембраны. Активация направленных внутрь выпрямляющих K⁺ (Kir) каналов, как и других K⁺ каналов, приводит к гиперполяризации клеточных мембран и вазодилатации. В этом исследовании свежевыделенные гладкомышечные клетки базилярной артерии были использованы для регистрации токов Kir с помощью метода зажима целых клеток. Исследовано влияние 100 мкмоль/л BaCl₂, ингибитора Kir-канала, и 10 мкмоль/л нитропруссида натрия (SNP), нитровазодилататора, на токи Kir-канала. Результаты показали, что BaCl₂ ингибирует токи Kir-канала в гладкомышечных клетках базилярной артерии, в то время как SNP усиливает эти токи. Этот протокол представляет собой исчерпывающее руководство по подготовке свежевыделенных артериальных гладкомышечных клеток и регистрации токов канала Kir с использованием техники патч-зажима, предлагая ценный ресурс для исследователей, стремящихся овладеть этим методом.

Цереброваскулярные заболевания являются распространенным заболеванием у пожилых людей. С повышением уровня жизни, увеличением продолжительности жизни и старением населения заболеваемость цереброваскулярными заболеваниями неуклонно^{растет1}. Базилярная артерия, непарный сосуд, образованный слиянием двусторонних позвоночных артерий, проходит под мостом внутри черепа и разделяется на две задние мозговые артерии. Он снабжает мост, мозжечок, задние отделы мозга и внутреннее ухо. Недостаточное кровоснабжение базилярной артерии может привести к эпизодическому головокружению, часто сопровождающемуся тошнотой и рвотой. Пациенты также могут испытывать такие симптомы, как шум в ушах, потеря слуха и другие связанные с этим проблемы. Эти симптомы часто связаны с такими состояниями, как шейный спондилез, церебральный атеросклероз и аномальное кровяное давление. Цереброваскулярные заболевания, особенно распространенные среди людей среднего и пожилого возраста, часто связаны с этими основными заболеваниями ^2,3,4.

Артерии сопротивления играют жизненно важную роль в сердечно-сосудистой функции и поддержании гомеостаза организма. Являясь основным местом сосудистого сопротивления, они регулируют кровяное давление и сердечный выброс, обеспечивая достаточный кровоток для удовлетворения метаболических и физиологических потребностей тканей и органов⁵. Базилярная артерия, классифицируемая как резистентная артерия, в первую очередь регулирует приток крови к стволу мозга⁶. Гладкомышечные клетки, которые формируют стенки артерий сопротивления, являются ключевыми медиаторами сосудистого сопротивления за счет регуляции стационарного сокращения или сосудистого напряжения. Эти клетки содержат многочисленные ионные каналы, в том числе K⁺-каналы,^Ca-2+ каналы и ^{Cl-каналы}, которые имеют решающее значение для модуляции сосудистого тонуса ^5,7.

К⁺ каналы имеют решающее значение в установлении мембранного потенциала и регуляции сократительного тонуса артериальных гладкомышечных клеток⁸. Существует четыре типа K⁺ каналов в гладкой мускулатуре артерий: потенциал-зависимый K⁺ (Kᴠ), Ca²⁺-зависимый K⁺ (K_Ca), АТФ-зависимый K⁺ (K_ATP) и внутренний выпрямитель K⁺ (Kir) каналы ^9,10,11. Kir-каналы подразделяются на семь подтипов, где Kir2.x — это классические kir-каналы. Среди них наиболее актуальными в сосудистой системе являются подсемейства Kir2.x. Токи Kir демонстрируют внутреннее выпрямление при отрицательных напряжениях, что указывает на суммарный приток K⁺ в ячейку, в то время как при положительных напряжениях суммарный^{ток K+} минимальен или отсутствует вовсе5. В сердечно-сосудистой системе каналы Kir необходимы для стабилизации мембранного потенциала. Их активация индуцирует гиперполяризацию клеточных мембран и вазодилатацию 12,13,14.

Эксперименты с наложением пластыря на свежевыделенных гладкомышечных клетках были проведены в различных артериях, включая коронарные, церебральные, почечные и брыжеечные артерии^15,16. В то время как некоторые методы используют один и тот же тип коллагеназы для выделения клеток, точные процедуры различаются. В немногих исследованиях были всесторонне обобщены методы выделения гладкомышечных клеток сосудов. Таким образом, данное исследование сосредоточено на свежей изоляции первичных сосудистых гладкомышечных клеток из базилярной артерии крысы и регистрации токов канала Kir в этих клетках с использованием техники цельноклеточного зажима, что обеспечивает подробный и полный протокол для исследователей в смежных областях.

Протокол для животных был одобрен Комитетом по этике благополучия лабораторных животных Университета традиционной китайской медицины в Чэнду (запись No 2024035). В данном исследовании использовались самцы крыс породы Спрэг-Доули (SD) массой тела 260-300 г и возрастом 8-10 недель. Животных кормили водой и пищей (SPF экспериментального корма для животных) в неограниченном количестве. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Диссекция базилярной артерии крысы

1. Приготовление раствора
   1. Приготовьте растворы, как описано в таблице 1.
2. Обезболить крысу путем ингаляции 2% изофлурана. Подтвердите глубокую анестезию с помощью щипки пальца ноги. При необходимости введите дополнительные анестетики. Немедленно приступайте к вскрытию черепа и обнажите мозг на портативном операционном столе.
3. Быстро перенесите мозг в чашку Петри, содержащую ПСС, насыщенный 95%_О2 и 5%_СО2 при 4 °С. Убедитесь, что pH раствора составляет 7,40.
4. Расположите мозг вентрально вверх в чашке Петри и закрепите ее иглами. Под световым микроскопом найдите базилярную артерию и осторожно удалите окружающие ткани с помощью автоклавного пинцета и ножниц (см. рисунок 1A).
5. Вставьте проволоку длиной 2 см и диаметром 25 мкм в изолированную базилярную артерию. Аккуратно потрите внутреннюю стенку проволокой, чтобы эффективно удалить эндотелий сосудов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Базилярная артерия у крыс расположена в базальной борозде ствола мозга у основания мозга и образована слиянием левой и правой позвоночных артерий^. Во время процесса изоляции обращайтесь с артерией осторожно, чтобы избежать чрезмерного растяжения или сжатия, которые могут привести к повреждению.

2. Выделение гладкомышечных клеток

1. Предварительно нагрейте 1 мл раствора для разделения клеток, 1 мл ферментативного гидролизата I и 1 мл ферментативного гидролизата II до 37 °C в пробирках 1, 2 и 3 соответственно (см. рисунок 1B).
2. Перенесите изолированную базилярную артерию в пробирку 2. Непрерывно вводите в пробирку смесь 95%_O2 и 5%_CO2 и поддерживайте ферментативную обработку в течение 30 минут (см. рисунок 1C).
3. Перенесите базилярную артерию из пробирки 2 в пробирку 3. Продолжайте вводить в трубку 95%_O2 и 5%_CO2 и поддерживайте ферментативную обработку в течение 5 минут (см. рисунок 1D).
4. Добавьте 1 мл раствора для разделения клеток при температуре 37 °C из пробирки 1 в пробирку 3. Продолжайте вводить 95%_O2 и 5%_CO2 , сохраняя ферментативную обработку в течение 3 минут. Растирайте препарат базилярной артерии для высвобождения клеток (см. рисунок 1E).
5. Добавьте разделительный раствор 4 °C в пробирку 3, чтобы завершить ферментативный процесс (см. рисунок 1F). Центрифугируйте смесь при 59 × г в течение 6 мин. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, снова добавьте раствор для разделения при температуре 4 °C (см. рисунок 1G) и дважды повторите центрифугирование для удаления остаточных ферментов.
6. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и храните 1 мл клеточной суспензии при температуре 4 °C до 6-8 ч.
7. Возьмите 100 мкл клеточной суспензии и поместите ее в ванну (см. рисунок 1H). Добавьте в ванну 1 мл внеклеточной жидкости и дайте клеткам отстояться в течение 40 минут, чтобы прикрепиться ко дну (см. рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для клеток в группе обработки (например, BaCl₂ или нитропруссид натрия) предварительно инкубируйте с соответствующими веществами при комнатной температуре (22-26°C) в течение 40 минут в течение периода прикрепления.

3. Регистрация тока Kir с помощью цельноклеточного патч-клеммы

1. Изготовление микропипеток
   1. Включите съемник микропипетки (см. Таблицу материалов).
   2. Поместите стеклянную трубку (внешний диаметр: 1,5 мм, внутренний диаметр: 1,10 мм, длина: 10 см) в съемник. Выберите Программу 1, нажмите Enter и откройте Программу 1. Проведите испытание на рампу, нажав кнопку «Рампа» на панели управления, чтобы измерить теплоту стеклянной трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отредактируйте программу 1 со следующими параметрами: Нагрев: Нарастание, Натяжение: 0, Скорость: 25, Задержка: 1, Давление: 500, Режим: Задержка, Безопасный нагрев включен. Испытание на рампу необходимо проводить при смене филаментов или типов стеклянных пипеток. Микропипетки должны иметь диаметр наконечника ~1-2 мкм и длину конуса примерно 5 мм. Меньший диаметр наконечников и более длинные конусы приводят к более высокому сопротивлению пипетки.
   3. Вставьте новую стеклянную трубку и выберите Программа 1. Нажмите Enter , чтобы изготовить микропипетку.
2. Запись Kir Current
   1. Последовательно включайте аппаратные устройства: цифро-аналоговый преобразователь, усилитель сигнала, микроманипулятор, микроскоп, камеру и компьютер.
   2. Запустите программное обеспечение в следующем порядке: камера, усилитель сигнала и программное обеспечение для сбора данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если микроскоп не оснащен камерой, то необходимо активировать только программное обеспечение прибора. Убедитесь, что программное обеспечение открыто после инициализации оборудования, чтобы обеспечить надлежащую функциональность.
   3. В программном обеспечении для сбора данных выберите «Файл» > «Задать имена файлов данных », чтобы установить путь к хранению данных.
   4. Отредактируйте протокол записи токов Kir следующим образом:
      1. Интерфейс осциллограммы: Эпоха A и D: Тип = шаг; Первый уровень = −60 мВ; Уровень дельты = 0 мВ; Первая продолжительность = 100 мс; Длительность дельты = 0 мс. Эпоха B: Тип = шаг; Первый уровень = −160 мВ; Уровень дельты = 0 мВ; Первая длительность = 1 мс; Длительность дельты = 0 мс. Эпоха C: Тип = рампа; Первый уровень = 40 мВ; Дельта напряжения = 20 мВ; Первая длительность = 500 мс; Длительность дельты = 0 мс.
      2. Интерфейс Mode/Rate: Пробная задержка = 0 с; Пробежки = 1; Развертки = 1; Продолжительность развертки = 0,8 с.
      3. Интерфейс выходов: Канал #0; Уровень удержания = −60 мВ. Сохраните и назовите протокол как "Kir protocol".
         ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка протокола адаптирована для конкретных текущих записей и может быть повторно использована после сохранения. Убедитесь, что выходной интерфейс совпадает с проводкой прибора (например, канал #0).
   5. Включите функцию Membrane Test в меню Tools программного обеспечения для сбора данных.
   6. Расположите ячейку для измерения в центре обзора камеры микроскопа.
   7. Погрузите наконечник контрольного провода в раствор для ванны. Заполните 20% микропипетки (изготовленной на шаге 3.1) внутриклеточным раствором и закрепите его на держателе записывающего электрода.
      1. Приложите положительное давление с помощью шприца, переместите наконечник пипетки в раствор для ванны и отрегулируйте смещение пипетки в программном обеспечении усилителя сигнала, чтобы установить базовую линию тока на 0 пА (см. рис. 3A).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте опорные провода Ag/AgCl. Сопротивление пипетки должно составлять 4-6 МОм.
   8. Аккуратно прижмите пипетку к клеточной мембране. Наблюдайте увеличение сопротивления уплотнения (Rt) по меньшей мере до 1 МОм (рис. 3B). Снимите положительное давление и приложите отрицательное давление для создания высокого сопротивления с Rt ≥ 1 ГОм (Рисунок 3C).
      1. Установите удерживающее напряжение на −60 мВ и компенсируйте емкость электродов с помощью Cp Fast и Cp Slow (Рисунок 3D).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если Rt остается выше 1 ГОм, перейдите к следующему шагу; В противном случае замените элемент или пипетку и повторите шаги 3.2.6-3.2.8.
   9. Приложите кратковременное отрицательное давление, чтобы разорвать клеточную мембрану, образуя цельную клеточную конфигурацию (Рисунок 3E). Выберите Whole Cell в программном обеспечении усилителя сигнала, нажмите Auto для компенсации емкости мембраны (рис. 3F), загрузите протокол Kir и начните запись данных. Повторите шаги 3.2.6-3.2.9 для обработанных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если последовательное сопротивление (Ra) составляет >30 МОм, выберите новую ячейку. Если 30 МОм > Ra > 10 МОм, примените компенсацию последовательного сопротивления перед записью. Для этого протокола требуется Ra < 10 МОм.
3. Анализ данных
   1. Откройте программу для анализа данных и загрузите записанные данные. Используйте курсоры для анализа текущих кривых и экспорта данных для построения кривых ВАХ.
   2. Создайте сигнал формы сигнала стимула, выбрав «Правка» > «Создать сигнал формы сигнала стимула », и подтвердите.
   3. Экспортируйте трассировку протокола Kir, выбрав Edit > Transfer Traces, указав полную область трассировки и сигнал (A0 #0) и скопировав данные для дальнейшего анализа.
   4. Экспортируйте репрезентативные текущие трассы Kir, выбрав Edit > Transfer Traces, указав полную область трассировки и сигнал (IN 0) и скопировав данные для создания текущих графиков трассировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация данных тока с использованием плотности тока (пА/пФ) для точного сравнения между ячейками различных размеров. Убедитесь, что емкость мембраны (Cm) регистрируется во время эксперимента¹⁷.

Выделение артериальных гладкомышечных клеток
В первом разделе процедуры подробно описан процесс выделения гладкомышечных клеток из базилярной артерии головного мозга крысы. Этот процесс проиллюстрирован на рисунке 1. Процедура включает в себя этапы ферментативного пищеварения и разделения клеток для высвобождения гладкомышечных клеток из артерии.

Репрезентативные изображения изолированных гладкомышечных клеток
Во втором разделе представлена репрезентативная диаграмма выделенных гладкомышечных клеток. На рисунке 2 представлены светлопольные изображения гладкомышечных клеток веретенообразной формы, подтверждающие их принадлежность к гладкомышечным клеткам на основе их характерной формы.

Техника зажима целых клеток
В третьем разделе представлена блок-схема метода патч-зажима для цельных клеток, используемого для регистрации токов Kir в только что выделенных гладкомышечных клетках. На рисунке 3 представлена подробная иллюстрация установки патч-зажима и процедур для создания конфигурации целой ячейки.

Запись тока Kir
В четвертой части представлен репрезентативный ток Kir, зарегистрированный из свежевыделенных гладкомышечных клеток с использованием метода патч-зажима для целых клеток. На рисунке 4 показаны зарегистрированные токи и влияние различных вмешательств на активность канала Kir. На рисунке 4А показан типичный ток Kir, демонстрирующий внутреннюю выпрямляемость при отрицательных напряжениях, что указывает на суммарный приток K+ в ячейку. При положительном напряжении суммарный ток K+ минимален или отсутствует. На рисунке 4B показано ингибирование токов Kir специфическим ингибитором BaCl₂. Результаты показывают, что Ba²⁺ в концентрациях 100-300 мкмоль/л эффективно блокирует Kir-каналы, подтверждая ток как Kir. На рисунке 4C показано влияние нитропруссида натрия (SNP), нитровазодилататора, на токи Kir. Данные показывают, что SNP увеличивает ток Kir, что предполагает участие Kir-каналов в SNP-индуцированной вазодилатации. На рисунке 4F представлены значения емкости (Cm) в группах control, BaCl₂ и SNP. Результаты не указывают на статистическую значимость значений Cm в этих группах.

Рисунок 1: Выделение артериальных гладкомышечных клеток. (A) Вентральная сторона мозга крысы и базилярная артерия. (B) Предварительный нагрев 1 мл раствора для разделения клеток, 1 мл ферментативного гидролизата I клетки и 1 мл ферментативного гидролизата II клетки до 37 °C в пробирках 1, 2 и 3 соответственно. (К-Е) Три этапа отделения клеток от сосудистой ткани с помощью ферментативного лечения. (Ф,Г) Окончание ферментативной обработки путем добавления разделительного раствора 4 °C. (H) Клеточная жидкость, содержащая артериальные гладкомышечные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Артериальные гладкомышечные клетки. (A) Светлопольный вид свежевыделенных гладкомышечных клеток сосудов, демонстрирующих веретенообразную морфологию. Масштабная линейка: 10 мкм. (B) Здоровые клетки, пригодные для экспериментов с патч-зажимом. Масштабная линейка: 30 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Процесс формирования патч-зажима для всей клетки. Это показывает результат испытания мембраны импульсным напряжением. (A) Пипетку опускают в ванну. (B) Записывающий электрод перемещается так, чтобы он соприкасался с ячейкой, и прижимается к мембране. (В) Образование высокопрочного уплотнения между пипеткой и клеткой. (D) Компенсация емкости электрода. (E) Разрыв клеточной мембраны. (F) Компенсация емкости клеточной мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4. Репрезентативный ток Kir в гладкомышечных клетках артерий. (A) Нормальный ток Kir. (B) Ингибирование специфическим ингибитором BaCl₂. (C) Влияние нитропруссида натрия (SNP) на ток Kir. (D) Вольт-амперная кривая кировых токов. (E) Статистические результаты. p < 0,05, BaCl₂ (n = 6) и SNP (n = 6) по сравнению с контрольной группой (n = 6); различия анализировали с помощью двухстороннего двустороннего ANOVA. (F) Cm (pF), p > 0,05, BaCl₂ (n = 6) и SNP (n = 6) по сравнению с контрольной группой (n = 6); Различия были проанализированы с помощью Т-критерия. Протокол стимуляции: Удержание при -60 мВ с линейной стимуляцией от -160 мВ до +40 мВ в течение 500 мс. Контроль, BaCl₂ и SNP проводили отдельно в разных группах клеток. Соединения добавлялись за 40 минут до записи и могли оставаться в ванне до 20 минут во время записи. SNP: нитропруссид натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Состав и меры предосторожности при приготовлении различных растворов.

Запись целых клеток с использованием свежевыделенных клеток восходит к началу 1980-х^годов18, а запись токов каналов от базилярных гладкомышечных клеток грызунов стала широко практиковаться в 1990-х^годах19. С развитием технологий исследователи все больше сосредотачиваются на результатах, достигнутых с помощью этих технологий. Однако внимание, уделяемое обновлению и обобщению технических методов, постепенно уменьшается. В данной статье представлен подробный метод свежего разделения гладкомышечных клеток сосудов и последующего использования этих клеток для регистрации токов Kir, с целью помочь исследователям в понимании стандартного методологического процесса.

Гладкие мышцы сосудов играют решающую роль в регулировании артериального давления. Сообщалось о многочисленных методах разделения сосудистых гладкомышечных клеток 20,21,22,23,24,25, большинство из которых включают ферментативный гидролиз. Тем не менее, типы и этапы ферментов варьируются в разных исследованиях, и различные условия эксперимента могут влиять на ферментативную эффективность. В данной статье представлен метод ферментативного гидролиза с небольшими изменениями в типах ферментов и процедурах по сравнению с предыдущими исследованиями. Он предоставляет подробный протокол для острого разделения первичных сосудистых гладкомышечных клеток.

Ключевыми этапами данного протокола являются шаги с 2.2 по 2.4, так как успешное выполнение этих этапов напрямую влияет на качество выделенных клеток. Выделенные гладкие мышечные клетки сосудов подходят для различных применений, включая эксперименты с патч-клэмпингом для изучения ионных каналов, экстракцию РНК и белков для молекулярных исследований и иммунофлуоресценцию для изучения экспрессии белков на клетках. Следовательно, этот метод предлагает универсальный подход для соответствующих исследователей, предоставляя больше экспериментальных возможностей.

Проводимость калия (K⁺) на мембране гладкомышечных клеток артерий играет решающую роль в регуляции мембранного потенциала, сосудистого напряжения и, в конечном счете, местного кровотока^26,27. Канал Kir, тип канала K⁺, обнаруженный в гладких мышечных клетках артерий, помогает стабилизировать мембранный потенциал и действует как электрический усилитель для других каналов K⁺. При активации канал Kir индуцирует гиперполяризацию мембраны и способствует расширению сосудов²⁸. Технология патч-хомутов долгое время считалась золотым стандартом для исследования ионных каналов^29,30, при этом патч-хомут для целых ячеек является наиболее часто используемым методом³¹. Хотя этот метод требует высокого уровня квалификации оператора, мастерство в конечном итоге зависит от следования стандартизированным протоколам.

В этом исследовании представлена детальная, стандартизированная процедура регистрации токов Kir из свежевыделенных сосудистых гладкомышечных клеток с использованием целоклеточного зажима, что является ценным ориентиром для исследователей. Критическими шагами в протоколе являются шаги с 3.2.7 по 3.2.9, так как успешное выполнение этих шагов определяет, будут ли успешными последующие записи тока Kir. Кроме того, выбор внутриклеточных жидкостей и жидкостей для ванн существенно влияет на регистрируемый ток. Например, использование внеклеточного калия с высоким содержанием калия в этом исследовании было направлено на полную активацию внутреннего выпрямителя калиевого канала. Поэтому успех эксперимента зависит от тщательного внимания к каждой детали операции.

В то время как свежевыделенные клетки имеют большую физиологическую значимость, чем клеточные линии, существуют внутренние ограничения. К ним относятся влияние температуры окружающей среды на ферментативное разделение, различное время переваривания кровеносных сосудов разного диаметра и нестабильность нативной среды клеток. В результате время ферментативного сбраживания часто приходится корректировать. Технология патч-зажимов также создает технические проблемы, особенно на этапах герметизации и разрыва мембраны, которые требуют высокой квалификации оператора. Состояние клетки напрямую влияет на успешность всей процедуры патч-зажима. Следовательно, тщательное внимание к этим ограничениям имеет важное значение для обеспечения успеха эксперимента.

Ba²⁺ широко используется в качестве специфического блокатора для изучения роли Kir-каналов в клетках и тканях. При концентрациях ниже 100 моль/л Ba²⁺ избирательно блокирует каналы Kir, в то время как концентрации до 300 моль/л могут полностью блокировать их³². В этом исследовании BaCl₂ использовался для проверки тока в канале Kir.

Кир-каналы регулируются как сосудосуживающими, так и сосудорасширяющими средствами. SNP (нитропруссид натрия), нитровазодилататор, был использован в этом исследовании для изучения этого. SNP метаболизируется в гладких мышцах сосудов с образованием оксида азота, который снижает системное сосудистое сопротивление, воздействуя как на венозные, так и на артериальные гладкие мышцы, потенциально увеличивая сердечный выброс. Благодаря быстрому началу и короткому периоду полувыведения, SNP обычно используется в качестве агента первой линии для профилактики и лечения гипертензии³³. В исследовании было отмечено, что SNP усиливает ток Kir в гладкомышечных клетках базилярной артерии, что предполагает активацию каналов Kir во время вазодилатации, вызванной SNP.

Ограничением настоящих записей является то, что они были получены из разных групп клеток, а сравнения проводились путем анализа текущих плотностей между группами. Более совершенный подход включает в себя регистрацию реакций одних и тех же клеток до и после применения соединений, что сведет к минимуму влияние вариабельности от клетки к клетке на интерпретацию данных.

В заключение данной статьи приводится подробный протокол острой изоляции гладкомышечных клеток базилярной артерии крысы и использования цельноклеточного зажима для изучения токов Kir. Этот протокол универсален и может быть применен к гладкомышечным клеткам из других артерий, таких как коронарные, брыжеечные и почечные артерии. Тем не менее, время ферментативного разделения может потребоваться скорректировать в зависимости от типа артерии. Кроме того, изолированные артериальные гладкомышечные клетки могут быть использованы во множестве других экспериментальных методов.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Эта работа была поддержана Специальной программой талантов Университета традиционной китайской медицины Чэнду в рамках «Плана содействия исследованиям ученых и талантов в области дисциплины Синлинь» (33002324) и Ключевым проектом исследований и разработок для представления научных и технологических талантов высокого уровня в городе Лулян (2022RC28).