Исследование бактериально-грибковых взаимодействий с использованием колонн Fungal Highway в различных средах и субстратах

Этот протокол содержит подробные инструкции о том, как конструировать, стерилизовать, собирать, использовать и повторно использовать колонны грибных магистралей для обогащения пар бактерия-грибок, взаимодействующих через грибковые магистрали из различных субстратов окружающей среды.

Бактериально-грибковые взаимодействия (БФИ) играют неотъемлемую роль в формировании состава микробного сообщества, биогеохимических функций, пространственной динамики и распространения микроорганизмов. Мицелиальные сети, созданные нитчатыми грибами или другими нитчатыми микроорганизмами (например, оомицетами), действуют как «грибковые магистрали», которые могут использоваться бактериями для транспортировки в гетерогенной среде, значительно облегчая их мобильность и предоставляя им доступ к областям, до которых может быть трудно или невозможно добраться самостоятельно (например, из-за воздушных карманов в почве). Для изучения этих грибных магистралей было создано несколько приборов и экспериментальных протоколов, в том числе колонн грибных магистралей. Грибковая магистральная колонка, разработанная нашей группой, может быть использована для различных применений in situ или in vitro , а также с различными типами образцов, связанных с окружающей средой и хозяином. В данной статье мы описываем методы проведения экспериментов с этими колонками, включая проектирование, печать, стерилизацию и подготовку устройств. Здесь также обсуждаются варианты анализа данных, полученных при использовании этих устройств, а также предлагаются советы по устранению неполадок в отношении потенциальных ловушек, связанных с экспериментами с использованием грибковых шоссейных колонн. Эти устройства могут быть использованы для получения более полного понимания разнообразия, механизмов и динамики грибковых магистральных BFI, чтобы получить ценную информацию о структурной и функциональной динамике в сложных средах (например, почвах) и в различных средах обитания, в которых бактерии и грибы сосуществуют.

Бактериально-грибковые взаимодействия (БФИ) чрезвычайно важны в формировании структурных, пространственных и функциональных свойств микробиомов окружающей среды. Например, рост и расширение нитчатых грибов или других грибоподобных нитчатых микроорганизмов создает биологическую сеть, которая может функционировать как «магистраль» для облегчения перемещения других микроорганизмов, таких как бактерии. Неоднородность и непостоянная насыщенность в субстратах окружающей среды могут препятствовать подвижности бактерий; Тем не менее, бактерии могут использовать эти магистрали для облегчения доступа к дополнительным районам окружающей среды ^1,2. Эти взаимодействия имеют решающее значение для понимания пространственной динамики микробных сообществ. Для изучения грибковых магистралей было использовано несколько техник и методов, однако они в значительной степени ограничены лабораторными исследованиями ^3,4.

При использовании одного из тарелочных методов большой участок агара удаляется из середины чашки Петри, создавая зазор между двумя островками агара. Грибковые гифы могут пересекать этот разрыв, обеспечивая средства для перехода совместимых бактерий с одного острова агара^{на другой.} Другие модифицированные методы чашки Петри включают в себя перевернутые пластины, в которых почва помещается в крышку, чтобы гифы грибов могли расти вертикально и колонизировать среду без прямого контакта, обеспечивая средства для транспортировки бактерий ^5,6. Недавно разработанный метод на основе капель питательной среды может быть использован для оценки селективного гифального транспорта бактерий в направлении определенных профилей питательных веществ⁷. Устройства для бактериальных мостов и троп также использовались для исследования влияния абиотических факторов на движение бактерий⁸. Несмотря на то, что для исследования грибковых магистралей было использовано несколько методов и техник, остается потребность в стандартизированных устройствах, которые поддерживают стерильную микросреду, способствуя в то же время созданию грибковых магистралей из сложных экологических субстратов, таких как навоз, почва и ризосферы.

Наша группа разработала напечатанную на 3D-принтере версию грибковых колонн, где грибы могут переносить бактерии из одного конца^{в другой.} Эти устройства собраны из четырех печатных компонентов: самой колонны в форме песочных часов и сложной внутренней решетчатой конструкции, кольца с резьбой и двух колпачков (большого колпачка и маленького колпачка), а также куска стерилизованной нейлоновой сетки (рисунок 1). Собранная колонна добавляется непосредственно в желаемую экологическую подложку. Затем колонка позволяет микробам колонизировать агаровую пробку для питательной среды, известную как пробка для среды «приманки», которая находится в нижней части колонки и контактирует с субстратом окружающей среды через сетку. Этот кусок нейлоновой сетки по размеру исключает других обитателей почвы, которые могут переносить бактерии, тем самым ограничивая перемещение бактерий внутри колонн до грибковых магистралей. После того, как эта пробка для приманки была колонизирована, нитчатые грибы могут распространяться и расти через внутреннюю решетку в центре колонны, которая предназначена для создания ненасыщенной системы, напоминающей почву (или другую ненасыщенную среду), и сводить к минимуму потенциальное загрязнение от приманочной среды. Затем грибы растут и колонизируют целевую среднюю пробку в верхней части колонны. Колонки могут быть либо инокулированы определенными грибковыми изолятами, чтобы проверить их способность транспортировать бактерии, либо их можно оставить неинокулированными, чтобы определить, какие грибы из субстрата способны транспортировать бактерии. Организмы, достигшие целевой среды, могут быть дополнительно культивированы, изолированы и подвергнуты анализу секвенирования (либо из чистых культур, либо из смешанных сообществ с использованием подходов ампликонного или метагеномного секвенирования). В целом, колонки представляют собой стандартизированный, воспроизводимый, многоразовый и интуитивно понятный метод исследования грибковых магистралей в различных субстратах. Эти устройства могут быть использованы для исследований и в качестве учебного пособия в классе, и здесь мы предоставляем обучающие шаги по их использованию на основе экспериментов, которые проводились в прошлом. Хотя этот метод облегчает стандартизацию протоколов, дизайн и конструкция устройств могут быть изменены для других применений и дополнительных подложек.

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Изменение конструкции, материалов и параметров колонны

1. Загрузите общедоступные проекты колонн⁹ и используйте их как есть или измените проекты колонн в совместимом программном обеспечении для автоматизированного проектирования (САПР).
2. Приобретите полимер для стоматологического хирургического шаблона или выберите альтернативный материал для 3D-печати, например, другие светочувствительные прозрачные смолы.
3. При необходимости отрегулируйте технические характеристики колонки, если выбранный 3D-принтер, технология 3D-печати или материал для 3D-печати отличаются от того, что использовалось ранее⁹.

2. 3D печать колонок

1. Установите параметры печати для использования толщины среза 0,05 мм и времени выдержки 0,8 с или отрегулируйте параметры печати в зависимости от выбранного принтера, материала для печати и программного обеспечения для печати.
2. Напечатайте столбики от грибов, кольца с резьбой и колпачки с помощью совместимого 3D-принтера (рис. 1).

Рисунок 1: Компоненты колонны грибного шоссе . (A,B) Вид сверху и сбоку на маленькую крышку, кольцо с резьбой и большую шляпку (слева направо). (К,Г) Вид сверху и сбоку на малую крышку. (Э,Ж) Вид сверху и сбоку на резьбовое кольцо. (Г,Н) Вид сверху и сбоку на большую шапку. (I) Фильтрующий элемент из нейлоновой сетки (25 мкм), помещенный в конец колонны и вставленный в подложку окружающей среды для предотвращения проникновения микрофауны внутрь колонны. (J) Колонка в разобранном виде. (K) Собранная колонна: конец «Приманки» уходит в субстрат, а конец «Мишени» остается открытым и выходит из субстрата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Очистка напечатанных на 3D-принтере компонентов колонны

1. Погрузите напечатанные колонки, колпачки и резьбовые кольца в 99% изопропиловый спирт при комнатной температуре на 15 минут и перемешивайте, перемещая ванну вперед и назад вручную в течение 10-15 секунд каждую минуту, чтобы удалить излишки смолы.
2. Переложите компоненты в ванну со свежим 99% изопропиловым спиртом. Погрузить на 5 минут и перемешивать вручную так же, как на шаге 3.1.
3. Переложите компоненты в ультразвуковой очиститель, наполненный чистой водой, погрузите компоненты и перемешивайте в течение 2 минут на средней скорости. Не нагревайте воду. Снимите компоненты.
4. Просушите все компоненты на воздухе не менее 30 минут.
5. Чтобы выполнить последующее отверждение смолы, подвергните все напечатанные на 3D-принтере компоненты воздействию света 405 нм в течение 30 минут при температуре 60 °C.

4. Стерилизация колонн

1. Если выбранный материал является автоклавируемым, отфильтруйте колонны, резьбовые кольца, колпачки и листы нейлоновой сетки толщиной 25 мкм по отдельности или в стакане большего размера в течение 20-30 минут при 121 °C, 1 атм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Компоненты колонны могут изменить форму и цвет после автоклавирования, но они сохранят желаемые свойства материала. Окончательный размер, форма и цвет компонентов колонны после автоклавирования показаны на рисунке 1.

5. Подготовка носителей для колонок

1. Приготовьте чашки Петри 90 мм из стерилизованных сред на основе агара: либо среды карбоксиметилцеллюлозы натрия (CMC), агара с солодовым экстрактом (MEA), агара картофельной декстрозы (PDA), либо агара Reasoner's 2A (R2A)^9,10. Подготовьте носитель в соответствии с инструкциями производителя.
   1. Стерилизуйте среду путем автоклавирования в течение 21 минуты или рекомендованного производителем времени при 121 °C, 1 атм и залейте в чашки Петри диаметром 90 мм до тех пор, пока агар не приблизится к верхней части стенок чашек Петри (Рисунок 2). Выполните этот шаг в шкафу биологической безопасности для повышения стерильности.
   2. Дайте агару застыть и высохнуть в соответствии с инструкциями производителя.

Рисунок 2: Процесс сборки колонн для грибных магистралей. Используя открытый конец самой колонки, пробка вырезается и вставляется, и исследователь поворачивает колонку, когда она удаляется из среды, чтобы убедиться, что пробка остается внутри конца колонки. Этот конец закрывается маленьким колпачком. Затем таким же образом на другой конец колонки добавляется заглушка для носителя. Затем на этот конец надевается сетчатый кусок и фиксируется кольцом с резьбой. Затем на этом конце «Приманки» используется большая крышка над резьбовым кольцом. Сторона с сеткой будет помещена в экологическую подложку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

6. Подготовка грибных столбиков

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап должен быть выполнен в шкафу биологической безопасности для поддержания стерильности компонентов колонны и среды. На рисунке 2 показан процесс сборки столба грибного шоссе.

1. Используйте сам конец колонки (без каких-либо крышек на нем) для извлечения заглушки носителя, которая плотно прилегает к одному из концов колонны. Используйте вращательное движение, когда колонна поднимается из среды, чтобы агар оставался внутри конца колонны. В качестве альтернативы можно использовать конец колонки в качестве шаблона, вырезать носитель и перенести его в колонку с помощью наконечника для дозатора.
2. После того как первая пробка будет добавлена в конец колонки, добавьте к нему малый колпачок для поддержания стерильной микросреды для целевой среды.
3. Переверните столбец и повторите шаг 6.1 для другого конца столбца.
4. Вырежьте с помощью стерилизованных ножниц круглый кусок из автоклавной нейлоновой сетки диаметром ~2 см (размер пор 25 мкм) (Рисунок 1). Наложите сетку на открытый конец колонны. Накрутите резьбовое кольцо на этот конец колонки для приманки, фиксируя сетку внутри нитей.
5. Поместите большой колпачок в нижней части колонны на сетку и другой конец резьбового кольца и не снимайте этот колпачок при хранении или транспортировке колонны.

7. Предварительная инокуляция субстрата или приманки в интересующий гриб

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным.

1. Инокулируйте интересующий гриб (например, грибок, который, как известно, создает грибковые магистрали) на желаемый субстрат, сначала вырастив гриб на твердой грибковой питательной среде (например, MEA, PDA; приготовленной, как описано в шаге 5) в чашке Петри и перенеся небольшой (~1 см) участок агара с видимым грибковым ростом на субстрат.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущих экспериментах⁹ использовали предварительно колонизированный навозный субстрат с Coprinopsis cinerea в течение 10 дней перед добавлением колонок к предварительно колонизированному субстрату.
2. Вместо того, чтобы предварительно колонизировать субстрат, добавьте грибок-приманку в чашку Петри или непосредственно на дно приманочного материала в колонне, используя небольшое количество грибкового мицелия (например, от взмаха стерильной петли).
   1. Для чашки Петри подождите, пока не появится видимый рост, покрывающий большую часть чашки Петри (около 50-75% покрытой пластины), затем выдавите секцию приманочной среды непосредственно из колонизированной чашки Петри, ближайшей к внешнему краю грибкового роста (как описано в шаге 6.1).
   2. При непосредственной предварительной колонизации прикормочной среды подождите, пока по всей прикормочной среде не появится явный рост, прежде чем добавлять колонку в субстрат (это, вероятно, займет несколько дней).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущих экспериментах⁹ в качестве приманочной среды использовались 14-дневные среды, предварительно колонизированные C. cinerea ; Время до колонизации будет варьироваться в зависимости от скорости роста гриба, типа среды и условий инкубации.

8. Подготовка контрольных процедур и репликации

1. Подготовьте отрицательные контрольные колонки (как описано в шагах 1-6), и не прививайте их и не помещайте их в субстрат. Используйте их, чтобы обеспечить исходный уровень для последующих анализов и оценить любые загрязнения в процессе подготовки.
2. Включите не менее трех реплик столбцов для любого эксперимента.

9. Добавление колонки в подложку

1. Обустройте лабораторный микромир (например, почву в коробке, горшке или пробирке; Рисунок 3А) или перенесите столбцы на интересующий вас участок поля.
2. Снимите большой колпачок с нижней части колонны, чтобы обнажить резьбовое кольцо и сетку.
3. Добавьте столбец в интересующий вас материал (рисунок 3), следуя конкретным соображениям для каждого типа подложки, описанным ниже. При необходимости и для минимизации повреждения сетки сделайте углубление в подложке с помощью руки в перчатке или небольшого инструмента (например, небольшого шпателя) перед введением колонки в основание.
   1. Навоз: Колонны ранее успешно применялись в свежем конском навозе. Храните навоз при температуре 4 °C перед использованием и добавляйте в камеры, такие как пурпурные коробки, перед добавлением колонок. Вставьте колонну в подложку так, чтобы она покрывала 1-2 см от общей высоты колонны.
   2. Почва: Вставьте колонны так, чтобы вся нижняя секция находилась в почве (~1-2 см глубины почвы) (Рисунок 3B). Колонны могут опираться на верхнюю часть почвы или быть закопаны прямо под маленьким колпаком на целевой стороне.
   3. Ризосфера: Вставьте колонны в почву, окружающую корни растений, как указано в шаге 9.3.2, наклоняя и размещая колонку близко к определенным корням, чтобы увеличить вероятность захвата ризосферных микроорганизмов (рисунок 3C).
   4. Субстраты в пробирках: Добавьте ~10 мл интересующего субстрата в коническую пробирку объемом 50 мл или аналогичную и при желании смочите субстрат (например, в условиях очень низкой влажности) чистой водой. Вставьте колонну в трубу так, чтобы дно было заглублено и не было видно частей резьбового кольца или сетки (рисунок 3A). Закрутите крышку пробирки объемом 50 мл и поместите ее в штатив для пробирок объемом 50 мл, чтобы она оставалась в вертикальном положении.

10. Оставление колонны в субстрате

1. Оставьте колонку в субстрате на 3-21 день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество времени, в течение которого колонки должны оставаться в своих субстратах, зависит от скорости роста любых используемых приманочных грибов, скорости роста грибов, которые колонизируют приманочный материал, и условий окружающей среды (например, сухие условия приводят к более быстрому высыханию среды, поэтому их нельзя использовать так долго).
2. Установите желаемый цикл света/темноты для эксперимента; В предыдущих экспериментах колонны в лаборатории находились в темноте, в то время как колонны в полевых условиях подвергались воздействию местных условий дня и ночи⁹.

11. Снятие колонны с подложки

1. После того, как колонна будет находиться в контакте с подложкой в течение желаемого периода времени, снимите колонну, осторожно стряхните излишки подложки и добавьте большую крышку обратно на дно колонны под сеткой для транспортировки колонны.
2. Поместите колонку в стерильный стакан или пробирку объемом 50 мл для транспортировки. Удерживайте колонну в вертикальном положении во время транспортировки.

12. Культивирование изолятов из целевой среды колонны

1. В стерильной среде, такой как шкаф биологической безопасности, снимите большую крышку защитного материала для приманки, резьбовое кольцо и сетку. Выбросьте сетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если исследователя интересует, какие организмы колонизировали приманочную среду, выполните шаги 12.3-12.4 с пробкой приманочной среды в дополнение к пробке целевой среды.
2. Снимите малый колпачок с торца колонки, содержащего целевую среду.
3. Извлеките пробку целевой среды, перевернув колонку, чтобы целевая пробка выпала из колонки, или используя стерилизованные щипцы или наконечники пипеток для извлечения пробки. Поместите пробку целевой среды непосредственно в центр чашки Петри диаметром 90 мм, заполненной агаровой средой по выбору (как приготовлено на шаге 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Грибковые или бактериальные среды могут быть использованы здесь для усиления роста представителей любого царства; пробка также может быть разделена на две или более частей с помощью стерилизованных ножниц или наконечника для пипетки, что позволяет наносить покрытие на несколько типов сред и/или сохранять целевые среды для экстракции ДНК (см. шаг 14).
4. Инкубируйте чашку Петри, модифицированную пробкой целевой среды, не менее 72 ч при температуре 25 °C в темноте.

13. Субкультивирование для выделения микроорганизмов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным.

1. Для бактерий: Используя стерильную петлю для инокуляции, проведите пальцем по одной интересующей колонии, сводя к минимуму контакт с другими областями чашки Петри. Выложите колонию на свежую чашку Петри диаметром 90 мм, содержащую предпочтительную бактериальную среду, такую как R2A (приготовленную на шаге 5), используя любой метод, который позволяет образовывать отдельные колонии (например, разрезание на четыре зоны). Инкубируйте чашку Петри в течение 24-72 ч при температуре 25-37 °C, проверяя рост колонии.
2. Для грибков: с помощью стерильной инокуляционной петли, стерильной бритвы или стерильного наконечника пипетки вырезайте минимальный (1 мм²) участок агара, содержащий гифальный рост. Поместите небольшой кусочек агара на свежую чашку Петри диаметром 90 мм, содержащую предпочтительную грибковую среду, такую как MEA или PDA, как приготовлено на шаге 5. Выдерживайте чашку Петри до одной недели при температуре 25 °C в темноте, ежедневно проверяя, чтобы предотвратить разрастание.
3. При необходимости повторяйте шаг 1 или шаг 2 до тех пор, пока морфология организма не станет однородной.

14. Извлечение ДНК из планшета или непосредственно из целевой среды

1. Заморозьте целые агаровые пробки (мишень и/или приманку) или выбранные части из колонок в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл при температуре -20 °C или погрузите части пробок в консервант в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл перед экстракцией, если экстракция не будет проведена немедленно.
2. Если было выполнено культивирование из целевой и/или приманочной среды, и если были предприняты последующие этапы субкультивирования, проштампуйте или вырезайте кусок агара размером ~1 см с грибковым или бактериальным ростом (или смесь того и другого, если последующие шаги изоляции не были предприняты).
   1. Для экстракции изолированных колоний бактерий смахните колонию с планшета с помощью стерильной инокуляционной петли и закрутите непосредственно в буфере для экстракции, связанном с коммерческим набором для экстракции ДНК (шаг 14.4).
3. Измельчите кусочки агара отдельно в жидком азоте с помощью ступки и пестика и перенесите измельченную ткань в экстракционные трубки.
4. Используйте коммерческий набор для экстракции ДНК, оптимизированный для почвы или бактерий и грибков, и следуйте инструкциям производителя для извлечения ДНК (см. Таблицу материалов).
5. Количественно оцените полученную ДНК с помощью флуориметра или аналогичной системы.

15. Оценка таксономического разнообразия микроорганизмов в целевых и/или приманочных средах с использованием подходов к ампликонному или метагеномному секвенированию

1. Выполните либо ампликонное секвенирование (16S и/или внутренний транскрибируемый спейсер [ITS]), либо метагеномное секвенирование, выполнив следующие действия:
   1. Ампликонное секвенирование: амплификация области гена V3-V4 16S рРНК с использованием праймеров Bakt 341F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') и Bakt 805R (5'-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-3'). Амплифицируйте область ITS2 гриба с помощью праймеров ITS3, KYO2 (5'-GAT, GAA, GAA, CGY, AGY, RAA-3') и ITS4 (5'-TCC, TCC, GCT, TAT, TGA, TAT, GC-3'⁾⁹.
   2. Подготавливайте библиотеки ампликонов с помощью коммерческих наборов для подготовки библиотек, совместимых с выбранным секвенсором. Секвенируйте ампликоны с помощью секвенсора с коротким чтением для генерации 150 или 250 парных считываний с достаточным покрытием, следуя инструкциям производителя платформы секвенирования для концентрации нагрузки.
   3. Метагеномное секвенирование: Создание метагеномной библиотеки из извлеченной ДНК с использованием коммерчески доступного набора для подготовки метагеномной библиотеки, совместимого с выбранным секвенатором. Секвенируйте библиотеку метагенома с помощью секвенатора коротких считываний, настроенного на генерацию 150 или 250 парных считываний пар оснований с достаточным покрытием (~10-20 Гб на метагеном), следуя инструкциям производителя платформы секвенирования для концентрации загрузки.

16. Анализ данных секвенирования

1. Анализ ампликонных данных: Использование платформы 11 QIIME2 с DADA2¹² для анализа ампликонных данных перед визуализацией результатов¹³. Выполните следующие действия, чтобы запустить QIIME2 на веб-платформе биоинформатики Empowering the Development of Genomics Expertise (EDGE)¹⁴. QIIME2 также можно запустить с использованием общедоступных учебных пособий, таких как руководство «Движущиеся изображения», предоставленное в Интернете (https://docs.qiime2.org/2024.2/tutorials/moving-pictures/).
   1. Перейдите в раздел https://edgebioinformatics.org/ и войдите в систему или создайте учетную запись.
   2. Выберите RUN QIIME2 на главной странице. Выберите «Загрузить файлы » в строке меню слева, чтобы загрузить файлы из циклов секвенирования ампликонов.
   3. Создайте файл сопоставления метаданных, следуя инструкциям, предоставленным при наведении указателя мыши на букву «i» рядом с «Файл сопоставления метаданных».
   4. Добавьте всю необходимую информацию (название проекта/прогона, тип чтения, параметры и т. д.) и выберите правильно загруженные входные данные. Убедитесь, что DADA2 выбран в качестве метода контроля качества¹²; Другие параметры могут быть оставлены в качестве значений по умолчанию, если не требуются другие изменения.
   5. Выберите тип ампликона: 16S Greengenes (http://greengenes.lbl.gov) для бактериальных ампликонов или Fungal ITS для грибковых ампликонов. Анализируйте данные о бактериях (16S) и грибах (ITS) независимо друг от друга.
   6. Нажмите кнопку «Отправить» и дождитесь окончания прогона, чтобы просмотреть результаты.
2. Создание визуализаций данных ампликонов (необязательно): выполняйте дополнительный анализ данных сообщества в R с помощью общих пакетов, таких как phyloseq (https://github.com/joey711/phyloseq), VEGAN (https://github.com/vegandevs/vegan) и APE (https://emmanuelparadis.github.io/), следуя рекомендациям, представленным на GitHub, и через справку по пакету R, доступную в R Studio, перейдя в меню Пакеты , щелкнув скачанный пакет и просмотрев документацию.
3. Анализ метагеномных данных
   1. Перейдите на сайт NMDC EDGE ¹⁵ (https://nmdc-edge.org/home) и войдите в систему, используя учетную запись ORCiD (https://orcid.org/).
   2. Выберите «Загрузить файлы » в строке меню в левой части экрана и перетащите или найдите правильный входной файл (файлы) FASTQ.
   3. Выберите «Метагеномика», затем выберите параметр «Запустить несколько рабочих процессов» в строке меню в левой части экрана и установите для всех рабочих процессов значение «Вкл.». Добавьте имя проекта и необязательное описание.
   4. Выберите загруженный файл (файлы) для чтения в необработанном формате (fastq) и выберите подходящий формат файла (чередующийся или парный).
   5. Запустите прогон, нажав « Отправить», и просмотрите сводные таблицы и визуализации после завершения прогона, выбрав проект на вкладке «Мои проекты » в верхней части экрана.

17. Создание дополнительных визуализаций данных таксономии на основе результатов ампликона и/или метагенома

1. Сгенерируйте круглые кладограммы с помощью пакета GraPhlAn (https://github.com/biobakery/graphlan), следуя инструкциям, представленным в GitHub.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификаторы таксономии (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy) Национального центра биотехнологической информации (NCBI) могут быть получены из репрезентативных присвоений последовательностей и переданы в программу «eftech» компании Entrez Direct E-utilities для сбора сведенной таксономической информации, требуемой в соответствии с GraPhlAn¹⁶.

18. Повторное использование столбцов

1. Если столбики все еще собраны, открутите и снимите крышки, резьбовое кольцо и сетку. Выбросьте сетку. Удалите все оставшиеся агаровые пробки, промойте колонки 99% изопропиловым спиртом и очищенной водой, очистите и высушите компоненты, как описано в шагах 3.1-3.4.
2. Подготовьте новые листы капроновой сетки для автоклавирования.
3. Выполните автоклавирование компонентов в соответствии с инструкциями, приведенными в шаге 4.1.

Полностью собранный столбик грибного шоссе имеет длину примерно 5 см (рисунок 1). Колонна не должна быть сломана ни на одном участке, а колпачки и резьбовое кольцо должны легко и плотно прилегать друг к другу для создания микроокружения внутри колонны. Сетка фильтра может выходить за пределы резьбового кольца (как показано на Рисунке 1 и Рисунке 2), или ее можно обрезать стерилизованными ножницами. Агаровые заглушки должны плотно прилегать к каждому концу колонны. При помещении в субстрат фильтрующая сетка должна соприкасаться с субстратом, при этом колонна не должна быть полностью заглублена.

Колонны предварительно испытывали в конском навозе⁹. Колонны также были помещены в объемный и ризосферный грунт на исследовательском поле, а также в небольшие объемы грунта в пробирках объемом 50 мл в лабораторных условиях (рис. 3). После того, как столбики грибов были удалены из субстрата и разобраны, рост микроорганизмов был виден как на приманке, так и на пробках целевой среды (примеры показаны на рисунке 4A). Бактерии и грибы были выделены из целевых и приманочных сред с помощью методов субкультивирования (рисунок 4B), а микробы, присутствующие на пробках среды, были таксономически идентифицированы с помощью секвенирования ампликонов (рисунок 4C, D). На рисунках 4C, D представлены объединенные результаты секвенирования ампликонов в нескольких экспериментах, показывающие, какие микробы смогли достичь пробки целевой среды из колонок, добавленных в конский навоз⁹. Визуализация этих бактериальных и грибковых данных была создана, как описано на шаге 17. Результаты также могут быть отображены в виде относительной численности таксонов.

Неоптимальные результаты были получены в тех случаях, когда колонки были добавлены в среду с экстремально низкой влажностью, а пробки среды были полностью высушены в течение нескольких дней, что привело к отсутствию восстановления колонизированных микробов (Рисунок 5A). Мы также видели случаи, когда микробы просто не растут из пробки целевой среды (рис. 5B), и случаи, когда мы не восстанавливали достаточные данные секвенирования из пробки целевой среды для содержательного анализа. Другие случаи, когда грибы разрастаются из колонок, также приводили к необходимости повторного проведения экспериментов (рис. 5C).

Рисунок 3: Примеры колонок, помещенных в пробы окружающей среды в лабораторных и полевых условиях. (A) Колонка, помещенная внутрь пробирки объемом 50 мл с увлажненной почвой в лабораторных условиях. Также показано с линейкой для масштабирования. (В) Колонна, помещенная в почву в поле. (В) Колонна, помещенная в корневую сеть растения в поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Репрезентативные результаты успешных экспериментов с колонками. (A) Примеры колонизированных пробок для среды, извлеченных из колонок. (B) Примеры грибковых изолятов, субкультивируемых из целевых сред. Субстратом служил грунт. Верхняя последовательность ITS NCBI BLAST идентичность слева направо: Rhizopus azygosporous, Aspergillus novofumigatus, Curvularia subpapendorfii и Phaeomycocentrospora cantuariensis. (C,D) Круговые кладограммы, отображающие филогенетическое разнообразие (C) грибковых ITS и (D) бактериальных 16S последовательностей, выделенных из целевых сред после многочисленных экспериментов с грибами с использованием конского навоза. Секции окрашены и помечены по типам, а концевые узлы представляют уникальные роды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5. Неоптимальные результаты экспериментов с колоннами. (A) Пример высохшей пробки среды, образовавшейся в результате низкой влажности окружающей среды. (B) Пример отсутствия роста микроорганизмов из пробки среды колонны. (В) Пример чрезмерного разрастания гриба через верхнюю (целевую среду) колонны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

При создании компонентов колонны выбор 3D-принтера и материала для печати может быть изменен в зависимости от доступности и желаемых свойств материала^17,18. Биосовместимость, текстура поверхности, автоклавируемость, возможность печати мелких деталей и относительная прозрачность — все это учитывалось при выборе материалов нашей группой. Также следует учитывать другие характеристики, такие как пористость, гидрофобность, параметры печати и т. д. Перед окончательным выбором были протестированы различные смолы (см. Таблицу материалов), и многие биосовместимые материалы подойдут для печати этих колонок. Материал, выбранный для изготовления компонентов колонны, определит, какие подходы к очистке, последующему отверждению и стерилизации следует использовать. Не все материалы можно автоклавировать, и в зависимости от инструкций производителя материала может потребоваться ультрафиолетовое излучение, отбеливатель или другие методы стерилизации. Некоторые методы стерилизации или очистки также могут повредить выбранный материал или быть несовместимыми с ним, поэтому особое внимание следует уделить этой информации от производителя материала. Для 3D-принтеров некоторые соображения включают время печати, совместимость материалов, размер платформы сборки, технологию печати и стоимость^. Напечатанные на 3D-принтере компоненты колонн могут быть хрупкими и могут сломаться при слишком сильном обращении. Резьба для кольца и колпачков не всегда может быть точно совмещена, поэтому мы рекомендуем напечатать и стерилизовать дополнительные компоненты перед этапом сборки или выполнить предварительную печать, чтобы проверить, как выбранные параметры и материал влияют на заправку. В зависимости от выбранного материала для 3D-печати может потребоваться корректировка проектных спецификаций для резьбы в колпачках и кольце. Размеры, сложность решетки и другие физические характеристики могут быть изменены в программном обеспечении для проектирования САПР перед печатью. По замыслу, сама колонна имеет высоту 4 см, а решетчатая структура в центре колонны имеет единичную ячейку размером 2 мм, диаметр стойки 0,5 мм, а вся высота решетки составляет 22 мм⁹ мм. Эти параметры можно регулировать, если исследователь хочет, например, более крупную или более сложную решетчатую структуру. В целом, 3D-печатное производство этих устройств обеспечивает гибкость проектирования, а также гарантирует, что один и тот же проект может использоваться стандартизированным образом в организациях и группах и даже использоваться в качестве учебного пособия^в классе.

Несколько этапов протокола могут потребовать устранения неполадок в зависимости от среды или экспериментальной настройки. Противогрибковые колонны не очень эффективны в условиях низкой влажности, так как пробки среды быстро высыхают, не способствуя росту грибков, что может ограничить продолжительность экспериментов в этих условиях (рис. 5A). Методы, которые повысили эффективность колонн в условиях низкой влажности, включают искусственное повышение влажности путем добавления влаги в подложку и/или герметизацию колонны и субстрата во вторичной емкости с источником воды (например, в небольшой емкости с чистой водой). Форма песочных часов и решетчатая структура были включены для предотвращения перемещения бактерий (без создания грибковой магистрали) в случае образования конденсата в среде с высокой влажностью. Быстрорастущие грибы могут зарастать площадь поверхности мишени и среды приманки и выходить за пределы верхней или нижней части колонки (рисунок 5C). Уменьшение времени инкубации гриба-приманки или продолжительности эксперимента может свести к минимуму или устранить этот разрастание. Кроме того, ограничением этих устройств является то, что быстрорастущие грибы в исследуемом субстрате могут ограничивать колонизацию приманки и целевых сред медленно растущими грибами, потенциально смещая наблюдаемые взаимодействия на магистралях. Некоторые грибы, особенно медленно растущие, могут не колонизировать приманочную среду таким образом, чтобы они могли расти через агаровую пробку и проникать в решетчатую структуру. Если в окружающей среде достаточная влажность, можно использовать более тонкие агаровые пробки, чтобы стимулировать рост в решетку после колонизации приманочной агаровой пробкой. Среда может быть выбрана в зависимости от того, хочет ли исследователь выбрать для роста грибков или бактерий, но это также может ограничить субкультивирование организмами, которые предпочитают этот тип среды²⁰. Если в целевой среде не наблюдается роста, возможно, потребуется инокулировать приманочную среду или субстрат грибком, который, как известно, создает грибковые магистрали.

Метагеномное или ампликонное секвенирование может быть выполнено в рамках этих экспериментов, и обе эти стратегии имеют свои собственные ограничения и сильные^{стороны.} Метагеномное секвенирование идеально подходит для получения дополнительной геномной информации о микробах. Тем не менее, извлекаемое количество нуклеиновых кислот непосредственно из целевой среды может быть очень низким, что может потребовать использования ампликонного секвенирования или других методов амплификации перед секвенированием. Библиотеки ампликонного секвенирования должны быть подготовлены отдельно (16S и ITS), и этот метод не имеет таксономического разрешения и ограничивает любые оценки особенностей генома или функционального потенциала, которые могут быть достигнуты с помощью метагеномного секвенирования. Методы прямого секвенирования из пробок могут быть предпочтительными в тех случаях, когда микробы не могут быть субкультивированы. Рекомендуется разделить пробки на несколько секций, чтобы обеспечить как культивирование, так и секвенирование.

Преимущество этих устройств в том, что их можно использовать как в лаборатории, так и в полевых условиях. Особое внимание должно уделяться тому, чтобы колонны в поле могли оставаться в вертикальном положении и были защищены от животных и возмущений окружающей среды, которые могут нарушить их размещение. Колонны еще не были испытаны в горизонтальном положении, в положении, когда они полностью покрыты подложкой, и они не были испытаны в условиях, подверженных значительному воздействию осадков или снега. Как указано выше, решетчатая структура была спроектирована таким образом, чтобы свести к минимуму вероятность того, что бактерии смогут переместиться в целевую среду в условиях высокой влажности. Тем не менее, возможно, что если бы столб подвергался воздействию больших объемов воды и эта вода полностью насыщала столб, движение бактерий было бы облегчено по всему столбу независимо от каких-либо присутствующих грибковых магистралей. Для лабораторных экспериментов колонки можно использовать в конических трубках объемом 50 мл, небольших микромирах субстратов, в почве вокруг горшечных растений, в ящиках или в других контролируемых экспериментальных системах. Колонны успешно используются в почве, ризосферах и навозе, и их применение может быть расширено на другие субстраты, включая опавшие листья, ил, песок, снег, компост и т. д.

Столбцы грибных магистралей позволяют провести ряд сравнений для понимания этого фенотипа BFI в различных типах выборок. Сравнение состава сообщества между приманкой и целевой средой может показать, какие бактерии могут использовать грибковые магистрали и какие грибы могут служить потенциальными магистралями⁹. Если используется метагеномное секвенирование, также могут быть изучены геномные особенности, которые отличают организмы от приманки от целевой среды. Также можно сравнивать целевые среды из колонн, размещенных в разных субстратах (например, в почве и навозе) или в одном и том же субстрате при разных условиях (например, при температуре или влажности). В целом, колонки грибных магистралей расширяют возможности предыдущих методов исследования этой формы BFI и позволяют проводить обширные исследования этих взаимодействий, которые формируют пространственную динамику сложных микробиомов окружающей среды.

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.

Это исследование было поддержано грантом Science Priority Area Grant от Министерства энергетики США (DOE), Биологических и экологических исследований (BER), Отдела науки о биологических системах (BSSD) в рамках гранта No LANLF59T.