التحقيق في التفاعلات البكتيرية والفطرية باستخدام أعمدة الطرق السريعة الفطرية في بيئات وركائز متنوعة

يوفر هذا البروتوكول إرشادات مفصلة حول كيفية بناء أعمدة الطرق السريعة الفطرية وتعقيمها وتجميعها واستخدامها وإعادة استخدامها لإثراء الأزواج البكتيرية والفطرية التي تتفاعل عبر الطرق السريعة الفطرية من ركائز بيئية متنوعة.

تلعب التفاعلات البكتيرية والفطرية (BFIs) دورا أساسيا في تشكيل تكوين المجتمع الميكروبي ، والوظائف البيوجيوكيميائية ، والديناميكيات المكانية ، والتشتت الميكروبي. تعمل الشبكات الفطرية التي تم إنشاؤها بواسطة الفطريات الخيطية أو الكائنات الحية الدقيقة الخيطية الأخرى (على سبيل المثال ، الفطريات الفطرية) بمثابة "طرق سريعة فطرية" يمكن أن تستخدمها البكتيريا للنقل عبر البيئات غير المتجانسة ، مما يسهل إلى حد كبير حركتها ويمنحها إمكانية الوصول إلى المناطق التي قد يكون من الصعب أو المستحيل الوصول إليها بمفردها (على سبيل المثال ، بسبب الجيوب الهوائية داخل التربة). تم إنشاء العديد من الأجهزة والبروتوكولات التجريبية لدراسة هذه الطرق السريعة الفطرية ، بما في ذلك أعمدة الطرق السريعة الفطرية. يمكن استخدام عمود الطريق السريع الفطري الذي صممته مجموعتنا لمجموعة متنوعة من التطبيقات في الموقع أو في المختبر ، وكذلك مع أنواع العينات البيئية المتنوعة والمرتبطة بالمضيف. هنا ، نصف طرق إجراء التجارب على هذه الأعمدة ، بما في ذلك تصميم الأجهزة وطباعتها وتعقيمها وإعدادها. تتم أيضا مناقشة خيارات تحليل البيانات التي تم الحصول عليها من استخدام هذه الأجهزة هنا ، ويتم تقديم نصائح حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها فيما يتعلق بالمزالق المحتملة المرتبطة بالتجارب باستخدام أعمدة الطرق السريعة الفطرية. يمكن استخدام هذه الأجهزة لاكتساب فهم أكثر شمولا لتنوع وآليات وديناميكيات BFIs الفطرية على الطرق السريعة لتوفير رؤى قيمة حول الديناميكيات الهيكلية والوظيفية داخل البيئات المعقدة (مثل التربة) وعبر الموائل المتنوعة التي تتعايش فيها البكتيريا والفطريات.

تعتبر التفاعلات البكتيرية والفطرية (BFIs) مهمة للغاية في تشكيل الخصائص الهيكلية والمكانية والوظيفية للميكروبيوم البيئي. على سبيل المثال ، يولد نمو وتوسع الفطريات الخيطية أو الكائنات الحية الدقيقة الخيطية الأخرى الشبيهة بالفطريات شبكة بيولوجية يمكن أن تعمل ك "طريق سريع" لتسهيل حركة الكائنات الحية الدقيقة الأخرى ، مثل البكتيريا. يمكن أن يؤدي عدم التجانس والتشبع غير المتسق داخل الركائز البيئية إلى إعاقة حركة البكتيريا. ومع ذلك ، يمكن للبكتيريا استخدام هذه الطرق السريعة لتسهيل الوصول إلى مناطق إضافية من البيئة^1،2. هذه التفاعلات ضرورية لفهم الديناميكيات المكانية للمجتمعات الميكروبية. تم استخدام العديد من التقنيات والأساليب لفحص الطرق السريعة الفطرية ، ومع ذلك ، فهي تقتصر إلى حد كبير على التحقيقات المختبرية^3،4.

في طريقة واحدة قائمة على اللوحة ، تتم إزالة جزء كبير من الأجار من منتصف طبق بتري ، مما يخلق فجوة بين جزيرتين من أجار. يمكن أن تجتاز الخيوط الفطرية هذه الفجوة ، مما يوفر الوسائل للبكتيريا المتوافقة للعبور من جزيرة أجار إلى أخرى⁵. تشمل طرق طبق بيتري المعدلة الأخرى الألواح المقلوبة حيث يتم وضع التربة في الغطاء بحيث يمكن أن تنمو الخيوط الفطرية عموديا وتستعمر الوسائط دون اتصال مباشر ، مما يوفر وسائل النقل البكتيري^5،6. يمكن استخدام طريقة قائمة على قطرات وسائط النمو تم تطويرها مؤخرا لتقييم النقل الخيطي الانتقائي للبكتيريا نحو ملامح معينة للمغذيات⁷. كما تم استخدام أجهزة الجسور والممرات البكتيرية للتحقيق في تأثير العوامل اللاأحيائية على حركة^{البكتيريا 8}. على الرغم من استخدام العديد من الطرق والتقنيات للتحقيق في الطرق السريعة الفطرية ، إلا أنه لا تزال هناك حاجة إلى أجهزة موحدة تحافظ على بيئة مكروية معقمة مع تعزيز إنشاء طرق سريعة فطرية من ركائز بيئية معقدة مثل الروث والتربة والجذور.

صممت مجموعتنا نسخة مطبوعة ثلاثية الأبعاد من أعمدة الطرق السريعة الفطرية حيث يمكن للفطريات نقل البكتيريا من طرف إلى آخر⁹. يتم تجميع هذه الأجهزة من أربعة مكونات مطبوعة: العمود نفسه على شكل الساعة الرملية وهيكل شبكي داخلي معقد ، وحلقة ملولبة ، وقبعين (غطاء كبير وغطاء صغير) ، بالإضافة إلى قطعة من شبكة النايلون المعقمة (الشكل 1). يضاف العمود المجمع مباشرة إلى الركيزة البيئية المطلوبة. يسمح العمود بعد ذلك للميكروبات باستعمار سدادة وسيطة نمو أجار تعرف باسم قابس وسائط "الطعم" الموجود في الجزء السفلي من العمود وعلى اتصال بالركيزة البيئية من خلال الشبكة. هذه القطعة من شبكة النايلون بحجم تستثني سكان التربة الآخرين الذين يمكنهم نقل البكتيريا ، وبالتالي الحد من حركة البكتيريا داخل الأعمدة إلى الطرق السريعة الفطرية. بمجرد استعمار سدادة الطعم هذه ، يمكن أن تمتد الفطريات الخيطية وتنمو من خلال الشبكة الداخلية داخل وسط العمود المصمم لإنشاء نظام غير مشبع يشبه التربة (أو غيرها من الوسائط غير المشبعة) وتقليل التلوث المحتمل من وسط الطعم. ثم تنمو الفطريات باتجاه السدادة المتوسطة المستهدفة في الجزء العلوي من العمود وتستعمرها. يمكن تلقيح الأعمدة بعزلات فطرية معينة لاختبار قدرتها على نقل البكتيريا ، أو يمكن تركها دون تلقيح لتحديد الفطريات من الركيزة القادرة على نقل البكتيريا. يمكن استزراع الكائنات الحية التي تصل إلى الوسط المستهدف وعزلها وإخضاعها لتحليلات التسلسل (إما من الثقافات النقية أو من المجتمعات المختلطة باستخدام مناهج التسلسل المختلط أو الميتاجينومي). بشكل عام ، توفر الأعمدة طريقة موحدة وقابلة للتكرار وقابلة لإعادة الاستخدام وبديهية لاستجواب الطرق السريعة الفطرية في ركائز متنوعة. يمكن استخدام هذه الأجهزة للبحث وكأداة تعليمية في الفصول الدراسية ، وهنا نقدم خطوات تعليمية لاستخدامها بناء على التجارب التي تم إجراؤها في الماضي. على الرغم من أن هذه الطريقة تسهل توحيد البروتوكول ، إلا أنه يمكن تعديل تصميم وبناء الأجهزة للتطبيقات الأخرى والركائز الإضافية.

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تعديل تصميم العمود والمواد والمعلمات

1. قم بتنزيل تصميمات الأعمدة^{المتاحة للجمهور 9} واستخدمها كما هي أو قم بتعديل تصميمات الأعمدة في برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر المتوافق (CAD).
2. احصل على راتنج التوجيه الجراحي للأسنان أو حدد مادة طباعة ثلاثية الأبعاد بديلة ، مثل الراتنجات الشفافة الأخرى الحساسة للضوء.
3. اضبط مواصفات العمود حسب الضرورة إذا تم تغيير الطابعة ثلاثية الأبعاد المختارة أو تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد أو مادة الطباعة ثلاثية الأبعاد عما تم استخدامه^{سابقا 9}.

2. 3D طباعة الأعمدة

1. قم بتعيين معلمات الطباعة لاستخدام سمك شريحة 0.05 مم ووقت تعريض ضوئي يبلغ 0.8 ثانية، أو اضبط معلمات الطباعة وفقا للطابعة ومواد الطباعة وبرنامج الطباعة المحدد.
2. اطبع أعمدة الطرق السريعة الفطرية والحلقات الملولبة والأغطية باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد متوافقة (الشكل 1).

الشكل 1: مكونات عمود الطريق السريع الفطري. (أ ، ب) المناظر العلوية والجانبية للغطاء الصغير والحلقة الملولبة والغطاء الكبير (من اليسار إلى اليمين). (ج، د) منظر علوي وجانبي للغطاء الصغير. (ه، و) منظر علوي وجانبي للحلقة الملولبة. (ز ، ح) منظر علوي وجانبي للغطاء الكبير. (I) قطعة مرشح شبكي من النايلون (25 ميكرومتر) موضوعة في نهاية العمود ، ويتم إدخالها في الركيزة البيئية لمنع الدقيقة من دخول العمود. (ي) عمود غير مجمع. (ك) العمود المجمع: يذهب طرف "الطعم" إلى الركيزة ، وتظل نهاية "الهدف" مكشوفة وخارجة من الركيزة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تنظيف مكونات العمود المطبوعة ثلاثية الأبعاد

1. اغمر الأعمدة المطبوعة والأغطية والحلقات الملولبة في كحول الأيزوبروبيل بنسبة 99٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وقم بتحريكها عن طريق تحريك الحمام ذهابا وإيابا يدويا لمدة 10-15 ثانية كل دقيقة لإزالة الراتنج الزائد.
2. انقل المكونات إلى حمام كحول الأيزوبروبيل الطازج بنسبة 99٪. اغمر لمدة 5 دقائق وحرك باليد بنفس الطريقة كما في الخطوة 3.1.
3. انقل المكونات إلى جهاز منظف بالموجات فوق الصوتية مملوء بالماء النقي ، واغمر المكونات ، وحركها لمدة دقيقتين على إعداد متوسط السرعة. لا تسخن الماء. قم بإزالة المكونات.
4. جفف جميع المكونات في الهواء لمدة 30 دقيقة على الأقل.
5. لإجراء المعالجة اللاحقة للراتنج ، قم بتعريض جميع المكونات المطبوعة ثلاثية الأبعاد لضوء 405 نانومتر لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية.

4. تعقيم الأعمدة

1. إذا كانت المادة المختارة قابلة للتعقيم ، فقم بالتعقيم بالأعمدة، والحلقات الملولبة، والأغطية، وألواح مرشح شبكة النايلون 25 ميكرومتر بشكل فردي أو داخل دورق أكبر لمدة 20-30 دقيقة عند 121 درجة مئوية، 1 ضغط جوي.
   ملاحظة: قد تتغير مكونات العمود شكلها ولونها بعد التعقيم ، لكنها ستحافظ على خصائص المواد المطلوبة. يظهر الحجم النهائي والشكل واللون لمكونات العمود بعد التعقيم في الشكل 1.

5. إعداد الوسائط للأعمدة

1. قم بإعداد أطباق بتري مقاس 90 مم من الوسائط المعقمة القائمة على أجار: إما وسط كربوكسي ميثيل السليلوز الصوديوم (CMC) ، أو مستخلص الشعير أجار (MEA) ، أو سكر العنب البطاطس أجار (PDA) ، أو أجار Reasoner's 2A (R2A) ^9،10. قم بإعداد الوسائط باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
   1. قم بتعقيم الوسائط عن طريق التعقيم لمدة 21 دقيقة أو الوقت الموصى به من قبل الشركة المصنعة عند 121 درجة مئوية ، 1 ضغط جوي ، واسكبه في أطباق بتري مقاس 90 مم حتى يقترب الأجار من الجزء العلوي من جوانب أطباق بتري (الشكل 2). قم بتنفيذ هذه الخطوة في خزانة السلامة البيولوجية لزيادة العقم.
   2. اترك أجار يتماسك ويجف بناء على تعليمات الشركة المصنعة.

الشكل 2: عملية التجميع لأعمدة الطرق السريعة الفطرية. باستخدام نهاية مفتوحة للعمود نفسه ، يتم قطع قابس وإدخاله ، ويقوم الباحث بلف العمود عند إزالته من الوسائط لضمان بقاء القابس داخل نهاية العمود. هذه النهاية مغطاة بقطعة الغطاء الصغيرة. ثم تتم إضافة قابس وسائط إلى الطرف الآخر من العمود بنفس الطريقة. ثم يتم وضع القطعة الشبكية فوق هذه النهاية وتثبيتها بالحلقة الملولبة. ثم يتم استخدام الغطاء الكبير على نهاية "الطعم" فوق الحلقة الملولبة. سيتم وضع الجانب مع الشبكة في الركيزة البيئية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. تحضير أعمدة الطرق السريعة الفطرية

ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في خزانة السلامة البيولوجية للحفاظ على عقم مكونات العمود والوسائط. يوضح الشكل 2 عملية تجميع عمود الطريق السريع الفطري.

1. استخدم نهاية العمود نفسها (بدون أي أحرف كبيرة) لاستخراج قابس وسائط يتناسب بإحكام مع أحد طرفي العمود. استخدم حركة التواء أثناء رفع العمود من الوسائط بحيث يظل الأجار داخل نهاية العمود. بدلا من ذلك، استخدم نهاية العمود كقالب، وقم بنحت الوسائط، وانقلها إلى العمود باستخدام طرف الماصة.
2. بعد إضافة القابس الأول إلى نهاية العمود ، أضف الغطاء الصغير إلى هذه النهاية للحفاظ على بيئة مكروية معقمة للوسائط المستهدفة.
3. اقلب العمود وكرر الخطوة 6.1 للطرف الآخر من العمود.
4. قم بقص قطعة دائرية بقطر ~ 2 سم من شبكة النايلون المعقمة (حجم المسام 25 ميكرومتر) باستخدام مقص معقم (الشكل 1). ضع الشبكة على الطرف المكشوف من العمود. قم بلف الحلقة الملولبة على طرف وسائط الطعم هذا للعمود أثناء تثبيت الشبكة داخل الخيوط.
5. ضع الغطاء الكبير في الجزء السفلي من العمود فوق الشبكة والطرف الآخر من الحلقة الملولبة ، واحتفظ بهذا الغطاء عند تخزين العمود أو نقله.

7. التلقيح المسبق للركيزة أو وسائط الطعم بفطر ذي أهمية

ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية.

1. تلقيح الفطريات ذات الأهمية (على سبيل المثال ، فطر معروف بإنشاء طرق سريعة فطرية) على الركيزة المرغوبة عن طريق زراعة الفطريات أولا على وسط نمو فطري صلب (على سبيل المثال ، MEA ، PDA ؛ محضر كما هو موضح في الخطوة 5) داخل طبق بتري ونقل قسم صغير (~ 1 سم) من أجار مع نمو فطري مرئي إلى الركيزة.
   ملاحظة: استخدمت التجارب السابقة⁹ ركيزة الروث قبل الاستعمار مع Coprinopsis cinerea لمدة 10 أيام قبل إضافة الأعمدة إلى الركيزة قبل الاستعمار.
2. بدلا من الاستعمار المسبق للركيزة ، أضف فطر الطعم إلى طبق بتري أو مباشرة إلى قاع وسط الطعم داخل العمود باستخدام كمية صغيرة من الفطريات الفطرية (على سبيل المثال ، من تمرير حلقة معقمة).
   1. بالنسبة لطبق بتري ، انتظر حتى يكون هناك نمو مرئي يغطي جزءا كبيرا من طبق بتري (حوالي 50٪ -75٪ من اللوحة المغطاة) ، ثم قم بالقضاء على قسم وسائط الطعم مباشرة من طبق بتري المستعمر الأقرب إلى الحافة الخارجية للنمو الفطري (كما هو موضح في الخطوة 6.1).
   2. عند الاستعمار المسبق لوسائط الطعم مباشرة ، انتظر حتى يكون هناك نمو واضح في جميع أنحاء وسائط الطعم قبل إضافة العمود إلى الركيزة (من المحتمل أن يستغرق ذلك عدة أيام).
      ملاحظة: استخدمت التجارب السابقة⁹ وسائط عمرها 14 يوما قبل الاستعمار مع C. cinerea كوسائط طعم. تختلف أوقات ما قبل الاستعمار اعتمادا على معدل نمو الفطريات ونوع الوسائط وظروف الحضانة.

8. تحضير علاجات التحكم والتكرارات

1. قم بإعداد أعمدة التحكم السلبية (كما هو موضح في الخطوات 1-6) ، ولا تقم بتلقيحها أو وضع هذه الأعمدة في الركيزة. استخدمها لتوفير خط أساس للتحليلات اللاحقة ولتقييم أي تلوث في عملية التحضير.
2. قم بتضمين ثلاث نسخ متماثلة على الأقل من الأعمدة لأي تجربة.

9. إضافة العمود إلى الركيزة

1. قم بإعداد عالم مصغر للمختبر (على سبيل المثال ، التربة داخل صندوق أو وعاء أو أنبوب. الشكل 3 أ) أو إحضار الأعمدة إلى موقع حقل محل اهتمام.
2. قم بإزالة الغطاء الكبير من أسفل العمود لكشف الحلقة الملولبة والشبكة.
3. أضف العمود إلى الركيزة محل الاهتمام (الشكل 3) باتباع الاعتبارات المحددة لكل نوع من أنواع الركيزة الموضحة أدناه. إذا لزم الأمر ، ولتقليل الضرر الذي يلحق بالشبكة ، قم بعمل انخفاض في الركيزة باستخدام يد مرتدية قفازا أو أداة صغيرة (على سبيل المثال ، مجرفة صغيرة) قبل إدخال العمود في الركيزة.
   1. Dung: تم استخدام الأعمدة سابقا بنجاح في روث الخيول الطازجة. قم بتخزين الروث في درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل الاستخدام وأضفه إلى الغرف ، مثل الصناديق الأرجوانية ، قبل إضافة الأعمدة. أدخل العمود في الركيزة لتغطية 1-2 سم من إجمالي ارتفاع العمود.
   2. التربة: أدخل الأعمدة بحيث يكون القسم السفلي بأكمله داخل التربة (~ 1-2 سم من عمق التربة) (الشكل 3 ب). يمكن أن تستقر الأعمدة على الجزء العلوي من التربة أو تدفن أسفل الغطاء الصغير على الجانب المستهدف.
   3. الجذور: أدخل الأعمدة في التربة المحيطة بجذور النباتات كما هو موضح في الخطوة 9.3.2 أثناء الزيادة ووضع العمود بالقرب من جذور معينة لزيادة فرص التقاط الكائنات الحية الدقيقة في الجذور (الشكل 3 ج).
   4. الركائز داخل الأنابيب: أضف ~ 10 مل من الركيزة ذات الأهمية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل أو ما شابه ذلك وبلل الركيزة إذا رغبت في ذلك (على سبيل المثال ، في بيئات الرطوبة المنخفضة جدا) باستخدام الماء النقي. أدخل العمود في الأنبوب بحيث يتم دفن الجزء السفلي ولا تظهر أي أجزاء من الحلقة أو الشبكة الملولبة (الشكل 3 أ). قم بلف غطاء الأنبوب سعة 50 مل مغلقا وضعه في رف أنبوب سعة 50 مل لإبقائه في وضع مستقيم.

10. ترك العمود في الركيزة

1. اترك العمود في الركيزة لمدة 3-21 يوما.
   ملاحظة: يعتمد مقدار الوقت الذي يجب أن تترك فيه الأعمدة في ركائزها على معدل نمو أي فطريات طعم مستخدمة ، ومعدل نمو الفطريات التي تستعمر وسط الطعم ، والظروف البيئية (على سبيل المثال ، تؤدي الظروف الجافة إلى جفاف أسرع للوسائط وبالتالي لا يمكن استخدامها لفترة طويلة).
2. إنشاء دورة الضوء / الظلام المرغوبة للتجربة ؛ أبقت التجارب السابقة الأعمدة داخل المختبر في الظلام ، بينما تعرضت الأعمدة في الميدان لظروف النهار والليل^{المحلية 9}.

11. إزالة العمود من الركيزة

1. بعد أن يكون العمود على اتصال بالركيزة للفترة الزمنية المطلوبة ، قم بإزالة العمود ، وتخلص بعناية من أي ركيزة زائدة ، وأضف الغطاء الكبير مرة أخرى إلى الجزء السفلي من العمود أسفل الشبكة لنقل العمود.
2. ضع العمود في دورق معقم أو أنبوب 50 مل للنقل. حافظ على العمود في وضع مستقيم أثناء النقل.

12. زراعة العزلات من الوسط المستهدف للعمود

1. في بيئة معقمة مثل خزانة السلامة البيولوجية ، قم بإزالة الغطاء الكبير لوسائط الطعم والحلقة الملولبة والشبكة. تجاهل الشبكة.
   ملاحظة: إذا كان الباحث مهتما بالكائنات الحية التي استعمرت وسط الطعم ، فاتبع الخطوات 12.3-12.4 باستخدام قابس الطعم المتوسط بالإضافة إلى القابس الوسيط المستهدف.
2. قم بإزالة الغطاء الصغير من نهاية العمود الذي يحتوي على الوسيط المستهدف.
3. أخرج القابس الوسيط المستهدف عن طريق قلب العمود للسماح للقابس المستهدف بالسقوط من العمود، أو باستخدام ملقط معقم أو أطراف ماصة لاستخراج القابس. ضع القابس المتوسط المستهدف مباشرة في وسط طبق بتري مقاس 90 مم مملوء بوسط أجار من اختيارك (كما هو موضح في الخطوة 5).
   ملاحظة: يمكن استخدام الوسائط الفطرية أو البكتيرية هنا لتعزيز نمو الأعضاء من أي من المملكتين. يمكن أيضا تقسيم القابس إلى قطعتين أو أكثر باستخدام مقص معقم أو طرف ماصة ، مما يسمح بالطلاء على أنواع وسائط متعددة و / أو الحفاظ على الوسائط المستهدفة لاستخراج الحمض النووي (انظر الخطوة 14).
4. احتضان طبق بتري الملقح بالسدادة المتوسطة المستهدفة لمدة 72 ساعة على الأقل عند 25 درجة مئوية في الظلام.

13. التثقيف الفرعي لعزل الكائنات الحية الدقيقة

ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية.

1. للبكتيريا: باستخدام حلقة تلقيح معقمة ، اسحب عبر مستعمرة واحدة ذات أهمية مع تقليل ملامسة المناطق الأخرى من طبق بتري. ضع المستعمرة على طبق بتري طازج مقاس 90 مم يحتوي على الوسط البكتيري المفضل ، مثل R2A (كما هو محضر في الخطوة 5) ، باستخدام أي طريقة تسمح بتكوين مستعمرات مفردة (على سبيل المثال ، الخطوط في أربع مناطق). احتضان طبق بتري لمدة 24-72 ساعة عند 25-37 درجة مئوية ، والتحقق من نمو المستعمرة.
2. للفطريات: باستخدام حلقة تلقيح معقمة أو ماكينة حلاقة معقمة أو طرف ماصة معقمة ، قم بنحت قسم بسيط (1 مم²) من أجار يحتوي على نمو خيوط. ضع قطعة صغيرة من الأجار على طبق بتري طازج مقاس 90 مم يحتوي على الوسط الفطري المفضل ، مثل MEA أو PDA ، كما هو محضر في الخطوة 5. احتضن طبق بتري لمدة تصل إلى أسبوع عند 25 درجة مئوية في الظلام ، وافحصه يوميا لمنع فرط النمو.
3. كرر الخطوة 1 أو الخطوة 2 حسب الضرورة حتى تصبح أشكال الكائن الحي متجانسة.

14. استخراج الحمض النووي من اللوحة أو مباشرة من الوسط المستهدف

1. قم بتجميد سدادات الأجار بأكملها (الهدف و / أو الطعم) أو القطع المحددة من الأعمدة في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل عند -20 درجة مئوية أو اغمر قطع من المقابس في مادة حافظة في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل قبل الاستخراج إذا لم يتم الاستخراج على الفور.
2. إذا تم إجراء الاستزراع من وسط الهدف و / أو الطعم ، وإذا تم اتخاذ خطوات ثقافة فرعية لاحقة ، فقم بختم أو نحت قطعة ~ 1 سم من الأجار مع نمو فطري أو بكتيري (أو مزيج من الاثنين معا إذا لم يتم اتخاذ خطوات العزل اللاحقة).
   1. لاستخراج المستعمرات البكتيرية المعزولة ، اسحب مستعمرة من اللوحة باستخدام حلقة تلقيح معقمة وقم بالتدوير مباشرة في مخزن الاستخراج المرتبط بمجموعة استخراج الحمض النووي التجارية (الخطوة 14.4).
3. طحن قطع الأجار بشكل منفصل في النيتروجين السائل باستخدام الهاون والمدقة وانقل الأنسجة الأرضية إلى أنابيب الاستخراج.
4. استخدم مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي التجارية المحسنة للتربة أو البكتيريا والفطريات ، واتبع تعليمات الشركة المصنعة لاستخراج الحمض النووي (انظر جدول المواد).
5. حدد كمية الحمض النووي الناتج باستخدام مقياس فلوري أو نظام مماثل.

15. تقييم التنوع التصنيفي الميكروبي في وسائط الطعم المستهدفة و / أو الطعم باستخدام مناهج التسلسل الطموح أو الميتاجينومي

1. قم بإجراء تسلسل أمبليكون (16S و / أو فاصل داخلي مكتوب [ITS]) أو تسلسل ميتاجينومي باتباع الخطوات التالية:
   1. تسلسل Amplicon: قم بتضخيم منطقة جين V3-V4 16S rRNA باستخدام البادئات Bakt 341F (5′-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3′) و Bakt 805R (5′-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-3′). قم بتضخيم منطقة ITS2 الفطرية باستخدام البادئات ITS3 KYO2 (5′-GAT GAA GAA CGY AGY RAA-3 ′) و ITS4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′) ⁹.
   2. إعداد مكتبات amplicon باستخدام مجموعات إعداد المكتبات التجارية المتوافقة مع جهاز التسلسل المختار. قم بتسلسل الأمبليكونات باستخدام جهاز تسلسل القراءة القصيرة لإنشاء 150 أو 250 قراءة مزدوجة للزوج الأساسي مع تغطية كافية باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمنصة التسلسل لتركيز التحميل.
   3. التسلسل الميتاجينومي: قم بإنشاء مكتبة ميتاجينومية من الحمض النووي المستخرج باستخدام مجموعة إعداد مكتبة ميتاجينومية متوفرة تجاريا ومتوافقة مع التسلسل المختار. قم بتسلسل مكتبة metagenome باستخدام مجموعة تسلسل القراءة القصيرة لإنشاء 150 أو 250 زوجا أساسيا مقترنا بتغطية كافية (~ 10-20 جيجابايت لكل ميتاجينوم) باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمنصة التسلسل لتركيز التحميل.

16. تحليل بيانات التسلسل

1. تحليل بيانات amplicon: استخدم منصة QIIME2 ¹¹ مع DADA2¹² لتحليل بيانات amplicon قبل تصور النتائج¹³. اتبع الخطوات أدناه لتشغيل QIIME2 في منصة المعلوماتية الحيوية المستندة إلى الويب لتمكين تطوير خبرة الجينوم (EDGE)¹⁴. يمكن أيضا تشغيل QIIME2 باستخدام البرامج التعليمية المتاحة للجمهور مثل دليل "الصور المتحركة" المقدم عبر الإنترنت (https://docs.qiime2.org/2024.2/tutorials/moving-pictures/).
   1. انتقل إلى https://edgebioinformatics.org/ وقم بتسجيل الدخول أو إنشاء حساب.
   2. حدد RUN QIIME2 من الصفحة الرئيسية. حدد تحميل الملفات في شريط القائمة الأيسر لتحميل الملفات من عمليات تشغيل تسلسل amplicon.
   3. قم بإنشاء ملف تعيين البيانات الوصفية باستخدام التعليمات المقدمة عند تمرير مؤشر الماوس "i" بجوار "ملف تعيين البيانات الوصفية".
   4. أضف جميع المعلومات المطلوبة (اسم المشروع / التشغيل ، نوع القراءة ، المعلمات ، إلخ) وحدد بيانات الإدخال التي تم تحميلها بشكل صحيح. التأكد من اختيار DADA2 كطريقة لمراقبة الجودة¹² ؛ يمكن ترك المعلمات الأخرى كقيم افتراضية ما لم تكن هناك حاجة إلى تعديلات أخرى.
   5. حدد نوع الamplicon إما 16S Greengenes (http://greengenes.lbl.gov) للأمبليكونات البكتيرية أو Fungi ITS للمضخمات الفطرية. تحليل البيانات البكتيرية (16S) والفطرية (ITS) بشكل مستقل.
   6. اضغط على إرسال وانتظر حتى ينتهي التشغيل لعرض النتائج.
2. إنشاء تصورات بيانات amplicon (اختياري): قم بإجراء تحليلات بيانات مجتمعية إضافية في R باستخدام حزم شائعة مثل phyloseq (https://github.com/joey711/phyloseq) و VEGAN (https://github.com/vegandevs/vegan) و APE (https://emmanuelparadis.github.io/) باتباع الإرشادات المتوفرة في GitHub ومن خلال تعليمات حزمة R المتوفرة في R Studio من خلال الانتقال إلى قائمة الحزم والنقر فوق الحزمة التي تم تنزيلها وعرض الوثائق.
3. تحليل البيانات الميتاجينومية
   1. انتقل إلى موقع NMDC EDGE ¹⁵ (https://nmdc-edge.org/home) وقم بتسجيل الدخول باستخدام حساب ORCiD (https://orcid.org/).
   2. حدد تحميل الملفات في شريط القائمة على الجانب الأيسر من الشاشة واسحب وأفلت أو تصفح بحثا عن ملف (ملفات) FASTQ الصحيح.
   3. حدد Metagenomics ، ثم خيار تشغيل مهام سير عمل متعددة في شريط القائمة على الجانب الأيسر من الشاشة ، وقم بتعيين جميع مهام سير العمل إلى تشغيل. أضف اسم المشروع ووصفا اختياريا.
   4. حدد ملف (ملفات) القراءة الأولية (fastq) التي تم تحميلها وحدد تنسيق الملف المناسب (متشابك أو مقترن).
   5. ابدأ التشغيل بالنقر فوق إرسال وعرض جداول الملخص والمرئيات عند اكتمال التشغيل عن طريق تحديد المشروع ضمن علامة التبويب مشاريعي في أعلى الشاشة.

17. إنشاء تصورات إضافية لبيانات التصنيف من نتائج amplicon و / أو metagenomic

1. قم بإنشاء مخططات دائرية باستخدام حزمة GraPhlAn (https://github.com/biobakery/graphlan) باتباع الإرشادات الواردة في GitHub.
   ملاحظة: يمكن الحصول على معرفات تصنيف (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy) للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) من تعيينات التسلسل التمثيلية وتمريرها إلى برنامج "eftech" الخاص ب Entrez Direct E-utilities لجمع معلومات مجموعة التصنيف المطلوبة بواسطة GraPhlAn¹⁶.

18. إعادة استخدام الأعمدة

1. إذا كانت الأعمدة لا تزال مجمعة ، فقم بفك وإزالة الأغطية والحلقة الملولبة والشبكة. تجاهل الشبكة. قم بإزالة أي سدادات أجار متبقية ، واغسل الأعمدة بكحول الأيزوبروبيل بنسبة 99٪ والماء النقي ، ونظف المكونات وجففها كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.4.
2. قم بإعداد صفائح جديدة من شبكة النايلون ليتم تعقيمها.
3. قم بتعقيم المكونات باتباع الإرشادات الواردة في الخطوة 4.1.

يبلغ طول عمود الطريق السريع الفطري المجمع بالكامل حوالي 5 سم (الشكل 1). لا ينبغي كسر العمود في أي منطقة ، ويجب أن تتلاءم الأغطية والحلقة الملولبة معا بسهولة وإحكام لإنشاء بيئات مصغرة داخل العمود. يمكن أن تمتد شبكة المرشح إلى ما وراء الحلقة الملولبة (كما هو موضح في الشكل 1 والشكل 2) ، أو يمكن قصها بمقص معقم. يجب أن تتناسب سدادات الأجار بشكل مريح في كل طرف من طرفي العمود. عند وضعها في الركيزة ، يجب أن تتلامس شبكة المرشح مع الركيزة ، ويجب عدم دفن العمود بالكامل.

تم اختبار الأعمدة سابقا في روث الحصان⁹. تم وضع الأعمدة أيضا في تربة سائبة وجذرية في موقع ميداني للبحث ، وكذلك في كميات صغيرة من التربة في أنابيب سعة 50 مل في المختبر (الشكل 3). بعد إزالة أعمدة الطرق السريعة الفطرية من الركيزة وتفكيكها ، كان النمو الميكروبي مرئيا على كل من سدادات الطعم والوسائط المستهدفة (الأمثلة الموضحة في الشكل 4 أ). تم عزل البكتيريا والفطريات من وسائط الهدف والطعم عبر تقنيات التثقيف الفرعي (الشكل 4 ب) ، وتم تحديد الميكروبات الموجودة على سدادات الوسائط تصنيفيا باستخدام تسلسل Amplicon (الشكل 4C ، D). يوضح الشكل 4C ، D النتائج المجمعة لتسلسل Amplicon عبر تجارب متعددة ، موضحا الميكروبات التي تمكنت من الوصول إلى سدادة الوسائط المستهدفة من الأعمدة المضافة إلى روث^{الحصان 9}. تم إنشاء تصورات لهذه البيانات البكتيرية والفطرية كما هو موضح في الخطوة 17. يمكن أيضا عرض النتائج على أنها وفرة نسبية من الأصناف.

تم الحصول على نتائج دون المستوى الأمثل في الحالات التي تمت فيها إضافة الأعمدة إلى بيئات منخفضة الرطوبة للغاية ، وتم تجفيف سدادات الوسائط تماما في غضون أيام ، مما أدى إلى عدم استعادة الميكروبات المستعمرة (الشكل 5 أ). لقد رأينا أيضا حالات لا تنمو فيها الميكروبات ببساطة من قابس الوسائط المستهدف (الشكل 5 ب) ، والحالات التي لا نستعيد فيها بيانات التسلسل الكافية من قابس الوسائط المستهدف لإجراء تحليلات ذات مغزى. أدت الحالات الأخرى التي تتكاثر فيها الفطريات خارج الأعمدة أيضا إلى الحاجة إلى إعادة إجراء التجارب (الشكل 5 ج).

الشكل 3: أمثلة على الأعمدة الموضوعة في العينات البيئية في المختبرات والبيئات الميدانية. (أ) عمود يوضع داخل أنبوب سعة 50 مل مع تربة مبللة في بيئة معملية. يظهر أيضا مع مسطرة للمقياس. (ب) العمود الموضوع في التربة في الحقل. (ج) عمود يوضع في شبكة جذر نبات في الحقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: النتائج التمثيلية من تجارب الأعمدة الناجحة. (أ) أمثلة على مقابس الوسائط المستعمرة المستخرجة من الأعمدة. (ب) أمثلة على العزلات الفطرية المستزرعة من الوسائط المستهدفة. كانت الركيزة تربة. أعلى تسلسل ITS NCBI BLAST هوية من اليسار إلى اليمين: Rhizopus azygosporous و Aspergillus novofumigatus و Curvularia subpapendorfii و Phaeomycocentrospora cantuariensis. (C ، D) مخططات دائرية تعرض تنوع النشوء والتطور ل (C) الفطريات ITS و (D) تسلسلات 16S البكتيرية التي تم استردادها من الوسائط المستهدفة بعد تجارب متعددة على الطرق السريعة الفطرية باستخدام روث الحصان. يتم تلوين الأقسام وتصنيفها حسب الشعبة ، مع وجود عقد طرفية تمثل أجناس فريدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5. نتائج دون المستوى الأمثل من تجارب الأعمدة. (أ) مثال على سدادة وسائط مجففة ناتجة عن الظروف البيئية ذات الرطوبة المنخفضة. (ب) مثال على عدم وجود نمو ميكروبي من سدادة وسائط عمودية. (ج) مثال على فرط نمو الفطريات من خلال الجزء العلوي (الوسط المستهدف) من العمود. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عند إنشاء مكونات العمود ، يمكن تعديل اختيار طابعة ثلاثية الأبعاد ومواد الطباعة بناء على التوافر وخصائص المواد المطلوبة^17،18. تم أخذ التوافق الحيوي ، وملمس السطح ، وقابلية التعقيم ، والقدرة على طباعة التفاصيل الدقيقة ، والشفافية النسبية في اختيار المواد الخاصة بمجموعتنا. يجب أيضا مراعاة الميزات الأخرى ، مثل المسامية ، والكراهية للماء ، ومعلمات الطباعة ، وما إلى ذلك. تم اختبار راتنجات مختلفة (انظر جدول المواد) قبل الاختيار النهائي ، وستعمل العديد من المواد المتوافقة حيويا لطباعة هذه الأعمدة. ستحدد المواد المختارة لبناء مكونات العمود طرق التنظيف والمعالجة اللاحقة والتعقيم التي يجب استخدامها. لن تكون جميع المواد قابلة للتعقيم ، وقد تكون هناك حاجة إلى الأشعة فوق البنفسجية أو المبيض أو تقنيات التعقيم الأخرى ، اعتمادا على تعليمات الشركة المصنعة للمواد. قد تتلف بعض تقنيات التعقيم أو التنظيف أيضا أو لا تكون متوافقة مع المادة المختارة ، لذلك يجب إيلاء اهتمام خاص لهذه المعلومات من الشركة المصنعة للمواد. بالنسبة للطابعات ثلاثية الأبعاد ، تتضمن بعض الاعتبارات وقت الطباعة ، وتوافق المواد ، وحجم منصة البناء ، وتكنولوجيا الطباعة ، والتكلفة¹⁹. يمكن أن تكون المكونات المطبوعة ثلاثية الأبعاد للأعمدة هشة وقد تنكسر إذا تم التعامل معها بقوة شديدة. قد لا تتماشى خيوط الحلقة والأغطية دائما تماما ، لذلك نوصي بطباعة المكونات الإضافية وتعقيمها قبل خطوة التجميع ، أو إجراء الطباعة الأولية لاختبار كيفية تأثير المعلمات والمواد المختارة على الخيوط. قد تحتاج مواصفات التصميم للخيوط داخل الأغطية والحلقة إلى التعديل اعتمادا على مادة الطباعة ثلاثية الأبعاد المختارة. يمكن تعديل الأبعاد والتعقيد الشبكي والميزات المادية الأخرى في برنامج تصميم CAD قبل الطباعة. كما هو مصمم ، يبلغ طول العمود نفسه 4 سم ، ويحتوي الهيكل الشبكي داخل وسط العمود على خلية وحدة بحجم 2 مم ، وقطر دعامة يبلغ 0.5 مم ، ويبلغ ارتفاع الشبكة بالكامل 22 مم⁹. يمكن تعديل هذه المعلمات إذا أراد الباحث ، على سبيل المثال ، بنية شبكية أكبر أو أكثر تعقيدا. بشكل عام ، يتيح التصنيع المطبوع ثلاثي الأبعاد لهذه الأجهزة مرونة التصميم مع ضمان إمكانية استخدام تصميم واحد بطريقة موحدة عبر المنظمات والمجموعات ، وحتى استخدامه كأدوات تعليمية في الفصول^{الدراسية 9}.

قد تتطلب عدة خطوات في البروتوكول استكشاف الأخطاء وإصلاحها اعتمادا على البيئة أو الإعداد التجريبي. أعمدة الطرق السريعة الفطرية ليست فعالة للغاية في ظروف الرطوبة المنخفضة ، حيث تجف سدادات الوسائط بسرعة قبل تسهيل نمو الفطريات ، مما قد يحد من مدة التجارب في هذه البيئات (الشكل 5 أ). تشمل التقنيات التي حسنت فعالية الأعمدة في البيئات منخفضة الرطوبة زيادة الرطوبة بشكل مصطنع من خلال إضافة الرطوبة إلى الركيزة و / أو إغلاق العمود والركيزة في حاوية ثانوية بمصدر للمياه (على سبيل المثال ، وعاء صغير من الماء النقي). تم دمج شكل الساعة الرملية والهيكل الشبكي لمنع حركة البكتيريا وحدها (دون إنشاء طريق سريع فطري) إذا كان التكثيف سيتشكل في بيئات عالية الرطوبة. قد تفرط الفطريات سريعة النمو في مساحة سطح الوسائط المستهدفة وتمتد من أعلى أو أسفل العمود (الشكل 5 ج). يمكن أن يؤدي تقليل وقت حضانة فطر الطعم أو مدة التجربة إلى تقليل أو القضاء على هذا النمو الزائد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أحد قيود هذه الأجهزة هو أن الفطريات سريعة النمو في الركيزة ذات الأهمية قد تحد من استعمار الطعم والوسائط المستهدفة بواسطة الفطريات بطيئة النمو ، مما قد يؤدي إلى تحيز التفاعلات على الطرق السريعة التي يتم ملاحظتها. قد لا تستعمر بعض الفطريات ، وخاصة الفطريات البطيئة نموا ، وسائط الطعم بطريقة تسمح لها بالنمو من خلال سدادة أجار وفي الهيكل الشبكي. إذا كانت هناك رطوبة كافية في البيئة ، فيمكن استخدام سدادات أجار أرق لتشجيع النمو في الشبكة بعد استعمار سدادة أجار الطعم. يمكن اختيار الوسائط بناء على ما إذا كان الباحث يريد اختيار نمو الفطريات أو البكتيرية ، ولكن هذا يمكن أن يحد أيضا من الزراعة الفرعية للكائنات الحية التي تفضل نوع الوسائط²⁰. إذا لم يلاحظ أي نمو في الوسائط المستهدفة ، فقد يكون من الضروري تلقيح وسط الطعم أو الركيزة بفطر معروف بإنشاء طرق سريعة فطرية.

يمكن إجراء تسلسل الميتاجينومي أو التمبليكون كجزء من هذه التجارب ، وكلتا الاستراتيجيتين تضفي حدودهما ونقاط قوتهما²¹. يعد التسلسل الميتاجينومي مثاليا للحصول على معلومات جينومية إضافية حول الميكروبات. ومع ذلك ، يمكن أن تكون الكمية القابلة للاسترداد من الأحماض النووية مباشرة من الوسائط المستهدفة منخفضة جدا ، مما قد يتطلب استخدام تسلسل الأمبليكون أو طرق التضخيم الأخرى قبل التسلسل. يجب إعداد مكتبات تسلسل Amplicon بشكل منفصل (16S و ITS) ، وتفتقر هذه الطريقة إلى الدقة التصنيفية وتحد من أي تقييمات حول ميزات الجينوم أو الإمكانات الوظيفية التي يمكن تحقيقها باستخدام التسلسل الميتاجينومي. قد تفضل طرق التسلسل المباشر من المقابس في الحالات التي لا يمكن فيها زراعة الميكروبات الفرعية. يوصى بتقسيم المقابس إلى أقسام متعددة لتمكين كل من أساليب الاستزراع والتسلسل.

تتمثل إحدى فوائد هذه الأجهزة في أنه يمكن استخدامها في كل من المختبر والميدان. يجب توخي الحذر بشكل خاص لضمان بقاء الأعمدة في الحقل منتصبة ومحمية من والاضطرابات البيئية التي يمكن أن تزعج موضعها. لم يتم اختبار الأعمدة بعد في وضع أفقي ، في وضع يتم تغطيتها بالكامل بواسطة ركيزة ، ولم يتم اختبارها في البيئات المعرضة لهطول أمطار غزيرة أو ثلوج. كما هو مذكور أعلاه ، تم تصميم الهيكل الشبكي لتقليل احتمالية قدرة البكتيريا على الانتقال إلى الوسط المستهدف في البيئات عالية الرطوبة. ومع ذلك ، فمن الممكن أنه إذا تعرض العمود لكميات أكبر من الماء وقام هذا الماء بتشبيع العمود بالكامل ، تسهيل الحركة البكتيرية في جميع أنحاء العمود بشكل مستقل عن أي طرق سريعة فطرية موجودة. بالنسبة للتجارب المعملية ، يمكن استخدام الأعمدة داخل أنابيب مخروطية سعة 50 مل ، أو عوالم صغيرة من الركائز ، أو في التربة المحيطة بالنباتات المحفوظة بوعاء ، أو في صناديق ، أو داخل أنظمة تجريبية أخرى خاضعة للرقابة. تم استخدام الأعمدة بنجاح في التربة والجذور والروث ، ويمكن توسيع فائدتها إلى ركائز أخرى ، بما في ذلك فضلات الأوراق ، والحمأة ، والرمل ، والثلج ، والسماد ، وما إلى ذلك.

تمكن أعمدة الطرق السريعة الفطرية عددا من المقارنات لفهم هذا النمط الظاهري BFI ضمن أنواع عينات متنوعة. يمكن أن تشير مقارنة تكوين المجتمع بين الطعم والوسائط المستهدفة إلى البكتيريا التي يمكنها استخدام الطرق السريعة الفطرية والفطريات التي يمكن أن تكون بمثابة طرق سريعة^{محتملة 9}. إذا تم استخدام تسلسل الميتاجينوم ، فيمكن أيضا فحص السمات الجينومية التي تميز الكائنات الحية عن الطعم مقابل الوسائط المستهدفة. من الممكن أيضا مقارنة الوسائط المستهدفة من الأعمدة الموضوعة في ركائز مختلفة (على سبيل المثال ، التربة مقابل الروث) أو الموضوعة في نفس الركيزة في ظل ظروف مختلفة (على سبيل المثال ، درجة الحرارة أو الرطوبة). بشكل عام ، تتوسع أعمدة الطرق السريعة الفطرية على قدرات الطرق السابقة لاستجواب هذا النوع من BFI وتمكن من إجراء فحوصات مكثفة في هذه التفاعلات التي تشكل الديناميكيات المكانية للميكروبيوم البيئي المعقدة.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

تم دعم هذا البحث من خلال منحة مجال التركيز العلمي من وزارة الطاقة الأمريكية (DOE) ، والبحوث البيولوجية والبيئية (BER) ، وقسم علوم النظام البيولوجي (BSSD) بموجب المنحة رقم LANLF59T.