使用真菌 Highway 色谱柱在不同环境和基材中研究细菌-真菌相互作用

该协议提供了有关如何构建、消毒、组装、利用和再利用真菌高速公路柱的详细说明，以丰富通过来自不同环境底物的真菌高速公路相互作用的细菌-真菌对。

细菌-真菌相互作用 （BFI） 在塑造微生物群落组成、生物地球化学功能、空间动力学和微生物扩散方面发挥着不可或缺的作用。由丝状真菌或其他丝状微生物（例如卵菌）产生的菌丝网络充当“真菌高速公路”，细菌可以利用这些途径在整个异质环境中运输，极大地促进了它们的移动，并使它们能够进入可能具有挑战性或无法自行到达的区域（例如，由于土壤中的气穴）。已经创建了几种设备和实验方案来研究这些真菌高速公路，包括真菌高速公路柱。我们小组设计的真菌 Highway 色谱柱可用于各种 原位 或 体外 应用，以及各种环境和宿主相关样品类型。在本文中，我们描述了使用这些色谱柱进行实验的方法，包括设计、打印、消毒和准备设备。本文还讨论了分析使用这些设备获得的数据的选项，并提供了有关使用真菌公路柱进行实验相关潜在陷阱的故障排除建议。这些设备可用于更全面地了解真菌高速公路 BFI 的多样性、机制和动力学，从而为复杂环境（例如土壤）以及细菌和真菌共存的不同栖息地的结构和功能动力学提供有价值的见解。

细菌-真菌相互作用 （BFI） 在塑造环境微生物组的结构、空间和功能特性方面极为重要。例如，丝状真菌或其他类似真菌的丝状微生物的生长和扩增会产生一个生物网络，该网络可以作为“高速公路”促进其他微生物（如细菌）的运动。环境底物内的异质性和不一致的饱和度会阻碍细菌的运动;然而，细菌可以利用这些高速公路来促进进入环境的其他区域 ^1,2。这些相互作用对于理解微生物群落的空间动力学至关重要。已经使用了几种技术和方法来检查真菌高速公路，但是，它们主要限于基于实验室的调查 ^3,4。

在一种基于板的方法中，从培养皿的中间去除一大段琼脂，在两个琼脂岛之间形成间隙。真菌菌丝可以穿过这个间隙，为相容的细菌从一个琼脂岛穿越到其他⁵ 个琼脂岛提供了手段。其他改良的培养皿方法包括倒置板，其中土壤放置在盖子中，以便真菌菌丝可以垂直生长并在培养基中定植，而无需直接接触，从而为细菌运输提供途径 ^5,6。最近开发的基于生长培养基液滴的方法可用于评估细菌对某些营养成分的选择性菌丝转运⁷。细菌桥和踪迹装置也被用于研究非生物因素对细菌运动的影响⁸。尽管已经使用了多种方法和技术来研究真菌高速公路，但仍需要标准化设备来维持无菌微环境，同时促进从复杂的环境基质（如粪便、土壤和根际）建立真菌高速公路。

我们小组设计了一种 3D 打印版本的真菌公路柱，真菌可以在其中将细菌从一端运送到另一端⁹.这些装置由四个打印组件组装而成：具有沙漏形状和复杂内部晶格结构的色谱柱本身、一个螺纹环和两个瓶盖（一个大瓶盖和一个小瓶盖），以及一块消毒尼龙网（图 1）。将组装好的色谱柱直接添加到所需的环境基质中。然后，该柱允许微生物定植在琼脂生长培养基塞（称为“诱饵”培养基塞）上，该塞位于柱底部，通过网片与环境基质接触。这块尼龙网的尺寸 - 不包括其他可以运输细菌的土壤居民，从而限制了细菌在柱内向真菌高速公路的运动。一旦这个诱饵塞定植，丝状真菌就可以通过柱子中心内的内晶格延伸和生长，该晶格旨在创建一个类似于土壤（或其他不饱和介质）的不饱和系统，并最大限度地减少诱饵介质的潜在污染。然后，真菌向柱顶部的目标培养基塞生长并定植。色谱柱可以接种特定的真菌分离物以测试其运输细菌的能力，也可以不接种以确定底物中的哪些真菌能够运输细菌。到达目标培养基的生物体可以进一步培养、分离并进行测序分析（来自纯培养物或使用扩增子或宏基因组测序方法来自混合群落）。总体而言，这些色谱柱提供了一种标准化、可重现、可重复使用且直观的方法，用于研究不同基材中的真菌高速公路。这些设备可用于研究和作为课堂教学工具，在此，我们根据过去进行的实验提供了使用它们的指导步骤。尽管这种方法有助于协议标准化，但可以针对其他应用和其他衬底修改器件的设计和构造。

材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 修改色谱柱设计、材料和参数

1. 下载公开发布的色谱柱设计⁹ 并按原样使用，或在兼容的计算机辅助设计 （CAD） 软件中修改色谱柱设计。
2. 获取牙科手术导板树脂或选择替代 3D 打印材料，例如其他光敏透明树脂。
3. 如果所选的 3D 打印机、3D 打印技术或 3D 打印材料与以前使用的 3D 打印机、3D 打印技术或 3D 打印材料不同，请根据需要调整色谱柱的规格⁹。

2. 3D柱打印

1. 将打印参数设置为使用 0.05 mm 的切片厚度和 0.8 秒的曝光时间，或者根据所选打印机、打印材料和打印软件调整打印参数。
2. 使用兼容的 3D 打印机打印真菌公路柱、螺纹环和盖子（图 1）。

图 1：真菌公路柱的组件。 （A，B） 小帽、螺纹环和大帽的顶视图和侧视图（从左到右）。（C，D）小盘股的顶部和侧视图。（东、女）螺纹环的顶视图和侧视图。（G，H）大盘股的顶视图和侧视图。（I） 放置在色谱柱末端的尼龙网状过滤器 （25 μm） 片，并插入环境基质中，以防止微生物进入色谱柱。（J） 未组装的色谱柱。（K） 组装柱：“诱饵”端进入底物，“目标”端保持未覆盖并离开底物。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. 清洁 3D 打印的色谱柱组件

1. 将打印的色谱柱、瓶盖和螺纹环在室温下浸入 99% 异丙醇中 15 分钟，然后每分钟用手来回移动浴槽 10-15 秒以去除多余的树脂。
2. 将组分转移到新鲜的 99% 异丙醇浴中。浸入水中 5 分钟，并以与步骤 3.1 相同的方式用手搅拌。
3. 将组分转移到装满纯水的超声波清洗器中，浸入组分，并以中速设置搅拌 2 分钟。不要加热水。删除组件。
4. 将所有组件风干至少 30 分钟。
5. 要对树脂进行后固化，请将所有 3D 打印组件在 60 °C 下暴露在 405 nm 光下 30 分钟。

4. 对色谱柱进行消毒

1. 如果所选材料是可高压灭菌的，则单独或在更大的烧杯中将色谱柱、螺纹环、瓶盖和 25 μm 尼龙网过滤器片在 121 °C、1 个大气压下高压灭菌 20-30 分钟。
   注：高压灭菌后，色谱柱的组分可能会改变形状和颜色，但它们将保持所需的材料特性。高压灭菌后色谱柱组分的最终尺寸、形状和颜色如图 1 所示。

5. 准备色谱柱的培养基

1. 制备 90 mm 无菌琼脂培养基培养皿：羧甲基纤维素钠培养基 （CMC）、麦芽提取物琼脂 （MEA）、马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 或 Reasoner 2A 琼脂 （R2A）^9,10。按照制造商的说明准备介质。
   1. 通过在 121 °C、1 个大气压下高压灭菌 21 分钟或制造商推荐的时间对培养基进行消毒，然后倒入 90 mm 培养皿中，直到琼脂接近培养皿侧面的顶部（图 2）。在生物安全柜中执行此步骤以提高无菌性。
   2. 根据制造商的说明让琼脂凝固并干燥。

图 2：真菌公路柱的组装过程。 使用色谱柱本身的开口端，切出并插入一个塞子，研究人员在从介质中取出色谱柱时扭转色谱柱，以确保塞子保持在色谱柱末端。那一端用小写字母封顶。然后以相同的方式将介质插头添加到色谱柱的另一端。然后将网片放在这一端并用螺纹环固定。然后将大帽用于螺纹环上方的 “诱饵 ”端。带有网眼的一面将被放置在环境基材中。 请单击此处查看此图的较大版本。

6. 准备真菌公路柱

注：此步骤应在生物安全柜中进行，以保持色谱柱组分和培养基的无菌状态。 图 2 说明了真菌公路柱的组装过程。

1. 使用色谱柱末端本身（上面没有任何盖子）提取一个紧密贴合色谱柱一端的介质塞。当柱子从培养基中抬起时，使用扭转运动，使琼脂保持在柱末端内。或者，使用色谱柱末端作为模板，切出培养基，然后使用移液器吸头将其转移到色谱柱中。
2. 将第一个塞子添加到色谱柱末端后，在此端添加小帽，以保持目标培养基的无菌微环境。
3. 将色谱柱翻转过来，然后对色谱柱的另一端重复步骤 6.1。
4. 使用消毒剪刀剪下直径为 ~2 cm 的高压灭菌尼龙网（25 μm 孔径）的圆形片（图 1）。将网片铺设在柱子的外露端上。将螺纹环拧到柱子的诱饵介质端，同时将网孔固定在螺纹内。
5. 将塔底部的大帽放在网孔和螺纹环的另一端，并在储存或运输塔时保持此帽。

7. 用感兴趣的真菌预接种底物或诱饵培养基

注意：此步骤是可选的。

1. 首先在培养皿内的固体真菌生长培养基（例如，MEA、PDA;如步骤 5 中所述制备）上培养真菌，并将一小段 （~1 cm） 具有可见真菌生长的琼脂转移到底物上，从而在所需的底物上接种感兴趣的真菌（例如，已知会产生真菌高速公路的真菌）。
   注：之前的实验⁹ 使用带有 Coprinopsis cinerea 的预定植粪便底物 10 天，然后将柱添加到预定植的底物中。
2. 不要预先定植底物，而是使用少量真菌菌丝体（例如，从无菌环的滑动）将诱饵真菌添加到培养皿中或直接添加到层析柱内诱饵培养基的底部。
   1. 对于培养皿，等到有可见的生长覆盖培养皿的大部分（约覆盖板的 50%-75%），然后直接从最靠近真菌生长外边缘的定植培养皿中挤出诱饵培养基部分（如步骤 6.1 中所述）。
   2. 直接预定植诱饵培养基时，请等到整个诱饵培养基有明显的生长，然后再将色谱柱添加到底物中（这可能需要几天时间）。
      注意：之前的实验⁹ 使用以 C. cinerea 作为诱饵培养基预先定植的 14 天龄培养基;定植前时间将根据真菌的生长速度、培养基类型和孵育条件而变化。

8. 准备对照处理和重复

1. 准备阴性对照柱（如步骤 1-6 中所述），不要接种它们或将这些柱放入底物中。使用它们为后续分析提供基线，并评估制备过程中的任何污染。
2. 任何实验至少包括三个列的重复。

9. 将色谱柱添加到基材上

1. 设置一个实验室缩影（例如，盒子、花盆或管子内的土壤; 图 3A）或将色谱柱带到感兴趣的现场。
2. 从色谱柱底部取下大瓶盖，露出螺纹环和网孔。
3. 按照下面描述的每种底物类型的具体注意事项，将色谱柱添加到感兴趣的底物中（图 3）。如有必要，为了尽量减少对网片的损坏，在将色谱柱插入基质之前，使用戴手套的手或小工具（例如小抹子）在基质上凹陷。
   1. 粪便：这些塔之前已成功用于新鲜马粪。使用前将粪便储存在 4 °C，并在添加色谱柱之前添加到腔室中，例如洋红色盒子中。将色谱柱插入基材中，以覆盖色谱柱总高度的 1-2 cm。
   2. 土壤：插入柱子，使整个底部部分都在土壤内（~1-2 厘米的土壤深度）（图 3B）。柱子可以放在土壤的顶部，也可以埋在目标侧的小帽正下方。
   3. 根际：按照步骤 9.3.2 中的指示将柱子插入植物根周围的土壤中，同时倾斜并将柱子放置在靠近某些根的位置，以增加捕获根际微生物的机会（图 3C）。
   4. 管内的底物：将 ~10 mL 的目标底物添加到 50 mL 锥形管或类似管中，并根据需要（例如，在极低湿度的环境中）使用纯水润湿底物。将色谱柱插入管中，使底部埋入，并且看不到螺纹环或网眼的任何部分（图 3A）。拧上 50 mL 试管的盖子，并将其放入 50 mL 试管架中以保持直立。

10. 将色谱柱留在基材中

1. 将色谱柱在底物中放置 3-21 天。
   注意：色谱柱需要在其基质中放置的时间长短取决于所使用的任何诱饵真菌的生长速率、定植诱饵培养基的真菌的生长速率以及环境条件（例如，干燥条件导致培养基干燥更快，因此不能长时间使用）。
2. 为实验建立所需的明/暗循环;之前的实验使实验室内的色谱柱处于黑暗中，而现场的色谱柱则受到当地的昼/夜条件^{的影响 9}。

11. 从基材上取下色谱柱

1. 在色谱柱与基质接触所需时间后，取出色谱柱，小心地抖掉任何多余的基质，然后将大瓶盖放回色谱柱底部，位于网孔下方，以运输色谱柱。
2. 将色谱柱放入无菌烧杯或 50 mL 试管中进行运输。在运输过程中保持色谱柱直立。

12. 从层析柱的目标培养基中培养分离物

1. 在无菌环境（如生物安全柜）中，取下诱饵培养基大盖、螺纹环和网眼。丢弃网格。
   注意：如果研究人员对哪些生物体定植了诱饵培养基感兴趣，请遵循步骤 12.3-12.4，除了目标培养基塞外，还要使用诱饵培养基塞。
2. 从包含目标培养基的柱端取下小瓶盖。
3. 通过翻转色谱柱让目标塞子从柱中脱落，或使用消毒的镊子或移液器吸头提取塞子，取出目标培养基塞子。将目标培养基塞直接放入装有所选琼脂培养基的 90 mm 培养皿的中心（如步骤 5 中制备的）。
   注意：此处可以使用真菌或细菌特异性培养基来促进来自任一界的成员的生长;也可以使用消毒剪刀或移液器吸头将塞子分成两块或多块，允许在多种培养基类型上铺板和/或保存目标培养基以进行 DNA 提取（参见步骤 14）。
4. 将接种有目标培养基塞的培养皿在25°C下在黑暗中孵育至少72小时。

13. 传代培养分离微生物

注意：此步骤是可选的。

1. 对于细菌：使用无菌接种环，在感兴趣的单个菌落上滑动，同时尽量减少与培养皿其他区域的接触。使用任何允许形成单个菌落的方法（例如，划线成四个区域），将菌落划线到含有首选细菌培养基（如 R2A）的新鲜 90 mm 培养皿上（如步骤 5 中制备）。将培养皿在 25-37 °C 下孵育 24-72 小时，检查菌落生长。
2. 对于真菌：使用无菌接种环、无菌剃须刀或无菌移液器吸头，切出含有菌丝生长的最小 （1 mm²） 琼脂切片。将一小块琼脂放在新鲜的 90 mm 培养皿上，该培养皿含有步骤 5 中制备的优选真菌培养基，例如 MEA 或 PDA。将培养皿在 25 °C 下避光孵育长达一周，每天检查以防止过度生长。
3. 根据需要重复步骤 1 或步骤 2，直到生物体形态均匀。

14. 从板中提取 DNA 或直接从目标培养基中提取 DNA

1. 在 -20 °C 下将整个琼脂栓（靶标和/或诱饵）或柱中的选定片段冷冻在 1.5 mL 离心管中，或在提取前将栓子片段浸入 1.5 mL 离心管中的防腐剂中（如果提取不会立即进行）。
2. 如果从目标和/或诱饵培养基进行培养，并且采取了后续的传代培养步骤，则印记或切出一段 ~1 cm 的琼脂，其中包含真菌或细菌生长（如果未采取后续分离步骤，则为两者混合）。
   1. 对于分离的细菌菌落的提取，使用无菌接种环从板中滑动菌落，并直接在与商业 DNA 提取试剂盒相关的提取缓冲液中旋转（步骤 14.4）。
3. 使用研钵和研杵在液氮中分别研磨琼脂块，并将磨碎的组织转移到提取管中。
4. 使用针对土壤或细菌和真菌优化的市售 DNA 提取试剂盒，并按照制造商的说明提取 DNA（参见 材料表）。
5. 使用荧光计或类似系统定量得到的 DNA。

15. 使用扩增子或宏基因组测序方法评估目标和/或诱饵培养基中的微生物分类多样性

1. 按照以下步骤进行扩增子测序（16S 和/或内部转录间隔区 [ITS]）或宏基因组测序：
   1. 扩增子测序：使用引物 Bakt 341F （5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3'） 和 Bakt 805R （5'-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-3' 扩增 V3-V4 16S rRNA 基因区域。使用引物 ITS3 KYO2 （5'-GAT GAA GAA CGY AGY RAA-3'） 和 ITS4 （5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3^′）9 扩增真菌 ITS2 区域。
   2. 使用与所选测序仪兼容的商业文库制备试剂盒制备扩增子文库。按照测序平台制造商的上样浓度说明，使用短读长测序仪对扩增子进行测序，以生成具有足够覆盖度的 150 或 250 个碱基对双端读长。
   3. 宏基因组测序：使用与所选测序仪兼容的市售宏基因组文库制备试剂盒，从提取的 DNA 中构建宏基因组文库。按照测序平台制造商关于上样浓度的说明，使用短读长测序仪组对宏基因组文库进行测序，以生成具有足够覆盖度的 150 或 250 个碱基对双端读长（每个宏基因组 ~10-20 Gb）。

16. 分析测序数据

1. 分析扩增子数据：在可视化结果之前，将 QIIME2 平台¹¹ 与 DADA2¹² 结合使用来分析扩增子数据¹³。按照以下步骤在基于 Web 的生物信息学平台中运行 QIIME2 基因组学专业知识发展 （EDGE）¹⁴ 。QIIME2 也可以使用公开可用的教程运行，例如在线提供的 “Moving Pictures” 指南 （https://docs.qiime2.org/2024.2/tutorials/moving-pictures/）。
   1. 导航到 https://edgebioinformatics.org/ 并登录或创建帐户。
   2. 从主页中选择 RUN QIIME2 。在左侧菜单栏中选择 Upload Files（上传文件 ），从扩增子测序运行中上传文件。
   3. 使用悬停在“元数据映射文件”旁边的“i”上时提供的说明创建元数据映射文件。
   4. 添加所有必需的信息（项目/运行名称、读取类型、参数等），然后选择正确的上传输入数据。确保选择 DADA2 作为质量控制方法¹²;除非需要其他修改，否则其他参数可以保留为默认值。
   5. 选择扩增子类型为细菌扩增子的 16S Greengenes （http://greengenes.lbl.gov） 或真菌扩增子的真菌 ITS。独立分析细菌 （16S） 和真菌 （ITS） 数据。
   6. 按 submit 并等待运行完成以查看结果。
2. 生成扩增子数据可视化（可选）：按照 GitHub 中提供的指导以及 R Studio 中提供的 R 包帮助，通过导航到“包 ”菜单，单击下载的包并查看文档，使用 phyloseq （https://github.com/joey711/phyloseq）、VEGAN （https://github.com/vegandevs/vegan） 和 APE （https://emmanuelparadis.github.io/）等常见包在 R 中执行其他社区数据分析。
3. 分析宏基因组数据
   1. 导航到 NMDC EDGE 站点¹⁵ （https://nmdc-edge.org/home） 并使用 ORCiD 帐户 （https://orcid.org/） 登录。
   2. 在屏幕左侧的菜单栏中选择 上传文件 ，然后拖放或浏览正确的输入FASTQ文件。
   3. 选择 Metagenomics，然后选择屏幕左侧菜单栏中的 Run Multiple Workflows 选项，并将所有工作流设置为 On。添加项目名称和可选描述。
   4. 选择上传的原始读取 （fastq） 文件，然后选择适当的文件格式（交错或配对）。
   5. 单击 Submit 开始运行，并在运行完成后通过在屏幕顶部的 My Projects 选项卡中选择项目来查看摘要表和可视化。

17. 从扩增子和/或宏基因组结果中创建分类数据的额外可视化

1. 按照 GitHub 中提供的说明使用 GraPhlAn （https://github.com/biobakery/graphlan） 包生成圆形分支图。
   注意：美国国家生物技术信息中心 （NCBI） 分类法 （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy） 标识符可以从代表性序列分配中获得，并传递给 Entrez Direct E-utilities 的“eftech”计划，以收集 GraPhlAn¹⁶ 所需的分类法汇总信息。

18. 重用列

1. 如果色谱柱仍在组装中，请拧下并取下瓶盖、螺纹环和网眼。丢弃网格。去除任何剩余的琼脂塞，用 99% 异丙醇和纯净水清洗色谱柱，然后按照步骤 3.1-3.4 中的说明清洁和干燥组分。
2. 准备新的尼龙网片进行高压灭菌。
3. 按照步骤 4.1 中提供的指导对组件进行高压灭菌。

完全组装的真菌公路柱长约 5 cm（图 1）。色谱柱的任何区域都不应破裂，瓶盖和螺纹环应轻松紧密地配合在一起，以在色谱柱内形成微环境。过滤网可以延伸到螺纹环之外（如图 1 和 图 2 所示），也可以用消毒剪刀修剪。琼脂塞子应紧贴色谱柱的每一端。当放入衬底中时，滤网应与衬底接触，色谱柱不应完全埋入。

色谱柱之前已在马粪⁹ 中进行了测试。这些色谱柱还被放置在研究现场的块状和根际土壤中，以及实验室中 50 mL 试管中的小体积土壤中（图 3）。从底物中取出真菌公路柱并拆卸后，诱饵和目标培养基塞上都可以看到微生物生长（示例如图 4A 所示）。通过传代培养技术从目标和诱饵培养基中分离细菌和真菌（图 4B），并使用扩增子测序对培养基塞上的微生物进行分类鉴定（图 4C、D）。图 4C，D 描述了多个实验中扩增子测序的综合结果，显示了哪些微生物能够从添加到马粪⁹ 中的柱到达目标培养基塞。如步骤 17 中所述，生成了这种细菌和真菌数据的可视化。结果也可以显示为分类群的相对丰度。

如果将色谱柱添加到极低湿度的环境中，并且填料塞在几天内完全干燥，导致定植微生物无法回收，则获得的结果并不理想（图 5A）。我们还看到了微生物根本不从目标培养基插头生长的情况（图 5B），以及我们没有从目标培养基插头中恢复足够的测序数据以进行有意义分析的情况。真菌从柱中过度生长的其他情况也导致需要重新进行实验（图 5C）。

图 3：在实验室和现场环境中放置在环境样品中的色谱柱示例。 （A） 在实验室环境中放置在装有湿润土壤的 50 mL 试管内。还显示有刻度尺。（B） 将柱子放置在田间的土壤中。（C） 放置在田间植物根网中的柱子。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：成功色谱柱实验的代表性结果。 （A） 从色谱柱中提取的定植培养基塞示例。（B） 从目标培养基中传代培养的真菌分离物示例。基质是土壤。顶部 ITS 序列 NCBI BLAST 身份从左到右： Rhizopus azygosporous、Aspergillus novofumigatus、Curvularia subpapendorfii 和 Phaeomycocentrospora cantuariensis。 （C，D） 圆形分支图显示了在使用马粪进行多次真菌公路实验后从目标培养基中回收的 （C） 真菌 ITS 和 （D） 细菌 16S 序列的系统发育多样性。切片按门着色和标记，终端节点代表独特的属。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5.色谱柱实验的结果欠佳。 （A） 由低湿度环境条件引起的干燥介质塞的示例。（B） 色谱柱填料塞没有微生物生长的示例。（C） 真菌通过色谱柱顶部（目标培养基）过度生长的示例。 请单击此处查看此图的较大版本。

在生成塔组分时，可以根据可用性和所需的材料特性来修改 3D 打印机和打印材料的选择^17,18。生物相容性、表面纹理、高压灭菌性、打印精细细节的能力和相对透明度都在我们小组的材料选择中被考虑在内。还应考虑其他特性，例如孔隙率、疏水性、打印参数等。在最终选择之前，测试了各种填料（参见材料表），许多生物相容性材料可用于这些色谱柱的打印。为构建色谱柱组件选择的材料将决定应使用哪种清洁、后固化和灭菌方法。并非所有材料都可以高压灭菌，并且可能需要紫外线、漂白剂或其他灭菌技术，具体取决于材料制造商的说明。某些消毒或清洁技术也可能损坏或与所选材料不兼容，因此应特别注意材料制造商提供的此信息。对于 3D 打印机，一些考虑因素包括打印时间、材料兼容性、构建平台尺寸、打印技术和成本¹⁹。色谱柱的 3D 打印组件可能很脆弱，如果处理得太用力，可能会破裂。环和瓶盖的螺纹可能并不总是完全对齐，因此我们建议在组装步骤之前打印额外的组件并对其进行消毒，或者进行初步打印以测试所选参数和材料如何影响螺纹。瓶盖和环内螺纹的设计规格可能需要根据所选的 3D 打印材料进行调整。尺寸、晶格复杂性和其他物理特征都可以在打印前在 CAD 设计软件中修改。按照设计，柱本身高 4 cm，柱中心内的晶格结构有一个 2 mm 大小的晶胞，支柱直径为 0.5 mm，整个晶格高度为 22 mm⁹。例如，如果研究人员想要更大或更复杂的晶格结构，则可以调整这些参数。总体而言，这些设备的 3D 打印制造实现了设计灵活性，同时还确保了单个设计可以跨组织和团体以标准化方式使用，甚至可以用作课堂教学工具⁹。

实验方案中的几个步骤可能需要进行故障排除，具体取决于环境或实验设置。真菌公路柱在低湿度条件下不是很有效，因为介质堵塞在促进真菌生长之前会迅速干燥，这会限制在这些环境中进行实验的持续时间（图 5A）。提高色谱柱在低湿度环境中有效性的技术包括通过向基质中添加水分来人为增加湿度和/或将色谱柱和基质密封在带有水源的二级容器（例如，一个小容器的纯水）中。沙漏形状和晶格结构的结合是为了防止在高湿度环境中形成冷凝时细菌单独移动（无需建立真菌高速公路）。快速生长的真菌可能会覆盖目标和诱饵培养基的表面积，并从柱的顶部或底部延伸出来（图 5C）。减少诱饵真菌的孵育时间或实验的持续时间可以最大限度地减少或消除这种过度生长。此外，这些设备的局限性是，目标基质中快速生长的真菌可能会限制缓慢生长的真菌对诱饵和目标培养基的定植，从而可能偏倚观察到的高速公路相互作用。一些真菌，尤其是生长较慢的真菌，可能无法以允许它们通过琼脂栓生长并进入晶格结构的方式在诱饵培养基中定植。如果环境中有足够的湿度，可以使用较薄的琼脂塞来促进诱饵琼脂塞定植后生长到晶格中。可以根据研究人员是否要选择真菌或细菌生长来选择培养基，但这也会将传代培养限制在喜欢该培养基类型²⁰ 的生物体中。如果在目标培养基中没有看到生长，则可能需要在诱饵培养基或底物中接种已知会产生真菌高速公路的真菌。

宏基因组或扩增子测序可以作为这些实验的一部分进行，这两种策略都有自己的局限性和优势²¹。宏基因组测序是获取有关微生物的其他基因组信息的理想选择。然而，直接从靶标培养基中纯化的核酸的可回收量可能非常低，这可能需要在测序前使用扩增子测序或其他扩增方法。扩增子测序文库必须单独制备（16S 和 ITS），这种方法缺乏分类分辨率，并限制了使用宏基因组测序可以实现的关于基因组特征或功能潜力的任何评估。在微生物无法传代培养的情况下，可能首选来自栓子的直接测序方法。建议将栓子分成多个部分，以便同时启用培养和测序方法。

这些设备的一个优点是它们既可以在实验室中使用，也可以在现场使用。必须特别小心，确保现场的色谱柱能够保持直立，并免受动物和环境干扰，以免干扰其放置。这些柱子尚未在水平位置、完全被基材覆盖的位置进行测试，也尚未在暴露于大量降雨或雪的环境中进行测试。如上所述，晶格结构旨在最大限度地降低细菌在高湿度环境中移动到目标介质的可能性。然而，如果色谱柱暴露在大量水中，并且这些水使色谱柱完全饱和，则细菌将在整个色谱柱中促进移动，而不受任何真菌高速公路的影响。对于基于实验室的实验，该色谱柱可用于 50 mL 锥形管内、基质的小缩微空间内、盆栽植物周围的土壤中、盒子中或其他受控实验系统中。这些塔已成功用于土壤、根际和粪便，其用途可以扩展到其他基质，包括落叶、污泥、沙子、雪、堆肥等。

真菌高速公路柱能够进行大量比较，以了解不同样品类型中的这种 BFI 表型。比较诱饵和目标介质之间的群落组成可以表明哪些细菌可以利用真菌高速公路，哪些真菌可以作为潜在的高速公路⁹。如果使用宏基因组测序，还可以检查区分生物体与诱饵和目标培养基的基因组特征。还可以比较放置在不同基质（例如土壤与粪便）中或放置在不同条件下（例如温度或湿度）中放置在同一基质中的色谱柱的目标介质。总体而言，真菌公路柱扩展了以前方法询问这种形式的 BFI 的能力，并能够对塑造复杂环境微生物组空间动力学的这些相互作用进行广泛检查。

作者没有任何需要披露的利益冲突。

这项研究得到了美国能源部 （DOE）、生物与环境研究部 （BER）、生物系统科学部 （BSSD） 的科学重点领域赠款的支持，资助编号为 LANLF59T。