Method Article
В данной статье демонстрируется возможность достижения более длительного времени перфузии (4 ч) мышиных сердечных трансплантатов без потери функции за счет использования более низкого (30-35 мм рт.ст.), чем физиологического (60-80 мм рт.ст.) перфузионного давления во время Лангендорфа.
Несмотря на важные достижения в диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), эта область остро нуждается в расширении исследований и научного прогресса. В результате, инновации, усовершенствования и/или перепрофилирование имеющегося набора исследовательских инструментов могут обеспечить улучшенные испытательные стенды для продвижения исследований. Перфузия Лангендорфа является чрезвычайно ценным методом исследования в области исследований сердечно-сосудистых заболеваний, который может быть модифицирован для удовлетворения широкого спектра экспериментальных потребностей. Такая адаптация может быть достигнута путем персонализации большого количества параметров перфузии, включая давление перфузии, расход, перфузат, температуру и т. д. Этот протокол демонстрирует универсальность перфузии Лангендорфа и возможность достижения более длительного времени перфузии (4 ч) без потери функции трансплантата за счет использования более низкого давления перфузии (30-35 мм рт.ст.). Достижение увеличенного времени перфузии без повреждения трансплантата и/или потери функции, вызванной самим методом, может устранить искажающие элементы из экспериментальных результатов. В действительности, в научных условиях, когда более длительное время перфузии имеет отношение к экспериментальным потребностям (т.е. лечение лекарствами, анализ иммунологического ответа, редактирование генов, сохранение трансплантата и т.д.), более низкое давление перфузии может быть ключом к научному успеху.
В области сердечно-сосудистых исследований были достигнуты важные успехи в диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Однако, несмотря на общее снижение заболеваемости и смертности, ССЗ остаются ведущей причиной смертности во всем мире 1,2. Этот тревожный факт подчеркивает необходимость активизации исследований и научного прогресса, который, несомненно, зависит от точности и предсказуемости имеющихся исследовательских инструментов. В результате возникает постоянная потребность в инновациях, совершенствовании и/или перепрофилировании исследовательского инструментария. Например, ретроградная перфузия сердца или перфузия сердца Лангендорфа, метод, доступный в этой области более века, может быть легко модифицирован для покрытия более широкого круга научных потребностей и достижения более широкого спектра применений.
Изоляция сердечного трансплантата от остального организма во время перфузии Лангендорфа обеспечивает важную степень контроля над широким спектром экспериментальных параметров, включая температуру, циркулирующий раствор, давление коронарной перфузии и т.д.3,4,5,6,7. Манипулирование этими параметрами облегчает моделирование большого числа кардиологических сценариев, которые могут быть использованы для дальнейшего научного прогресса 5,8,9,10. Среди этих параметров давление перфузии, вероятно, является наиболее упускаемым из виду экспериментальным параметром11.
Во время синдрома Лангендорфа перфузионное давление демонстрирует прямую корреляцию с частотой сердечных сокращений, пиковым систолическим/диастолическим давлением и потреблением кислорода11. Эта корреляция обеспечивает прямой и точный контроль над объемом работы, производимой сердечными трансплантатами, которые могут быть скорректированы в соответствии с индивидуальными экспериментальными потребностями. Несмотря на эту ценную возможность контроля, исторически сложилось так, что отрасль тяготела к использованию более высоких перфузионных давлений (60-80 мм рт.ст.), подвергая все сердечные трансплантаты высокой рабочей нагрузке, независимоот экспериментальных потребностей. Последствия этого неоправданно высокого спроса на работу вытекают из всеобъемлющего принципа, согласно которому переработка имеет тенденцию приводить к преждевременному выходу из строя. Это, по-видимому, особенно верно для сердечных трансплантатов, перфузированных с помощью Лангендорфа, поскольку нефизиологичность этого метода и отсутствие поддержки восстановления, присутствующей in vivo, по-видимому, усугубляют отторжение трансплантата. Эта преждевременная потеря функции трансплантата значительно ограничивает время перфузии и эксперимента. В действительности, в обстоятельствах, когда более длительное время перфузии более актуально для экспериментальных потребностей (т.е. медикаментозное лечение, анализ иммунологического ответа, редактирование генов, сохранение трансплантата и т.д.), более низкая сердечная нагрузка может быть оправдана в обмен на повышенную долговечность трансплантата.
Этот протокол демонстрирует возможность использования более низких перфузионных давлений (30-35 мм рт.ст.) во время Лангендорфа, а также значительное влияние, которое они оказывают на функцию сердечного трансплантата с течением времени по сравнению с более высокими перфузионными давлениями (60-80 мм рт.ст.). Кроме того, результаты, представленные в этой рукописи, подчеркивают важность приоритизации настройки широкого спектра параметров перфузии для лучшего удовлетворения экспериментальных потребностей.
Это исследование проводится в соответствии с рекомендациями Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля.
1. Проектирование системы
2. Приготовление перфузата
3. Настройка перфузионной системы
4. Подготовка к забору сердечного трансплантата
5. Заготовка сердечного трансплантата
6. Инициация перфузии
7. Внутрижелудочковый баллон:
8. Отбор проб
9. Окончание/очистка
Сердца взрослых самцов крыс породы Льюис (250-300 г массы тела) собирали и перфузировали при высоком (70-80 мм рт. ст.) или низком (30-35 мм рт. ст.) перфузионном давлении (n = 3 на группу). Влияние перфузионного давления на общую сердечную функцию и здоровье определяли путем сбора данных о частоте сердечных сокращений, отеке и функции левого желудочка.
Была определена четкая корреляция между частотой сердечных сокращений и перфузионным давлением (рис. 2). Частота сердечных сокращений была статистически выше в сердцах с высоким давлением по сравнению с сердцами с низким давлением во все временные точки, кроме первого (60 мин, рис. 2A, B). Интересно, что сердца с низким давлением, по-видимому, претерпевают период адаптации в начале перфузии, когда потребовалось около 30 минут, чтобы частота сердечных сокращений стабилизировалась и достигла уровней, которые поддерживались в течение оставшейся части перфузии (Рисунок 2A). Между группами также наблюдалась большая разница в пульсовом давлении левого желудочка (ЛЖЖ), при этом НЖЖ у сердец с высоким давлением был статистически выше, чем у сердец с низким давлением в каждый момент времени (рис. 3B). Этот устойчиво высокий спрос на работу привел к прогрессирующей потере функции в сердцах с высоким давлением со статистическим снижением LVPP, наблюдаемым после 2 ч перфузии (Рисунок 3A, B). С другой стороны, в сердцах с перфузией с низким давлением не наблюдалось потери функции, при этом LVPP оставалась неизменной в течение всего времени перфузии (рис. 3A, B). Подобно LVPP, сердца с высоким давлением демонстрировали более высокое сокращение сердечной мышцы (dP/dtmax) и расслабление (dP/dtmin) на протяжении всего времени перфузии по сравнению с сердцами с низким давлением (рис. 3C, D). В соответствии с этим, сердца с высоким давлением претерпевали прогрессирующую потерю сократительной способности и способности к расслаблению, причем оба параметра были статистически выше через 1 ч после начала перфузии по сравнению с последним часом перфузии. С другой стороны, сократительная способность сердечной мышцы и способность к расслаблению были сравнительно низкими в группе с низким давлением и оставались неизменными в течение 4 часов времени перфузии (рис. 3C, D). В дополнение к функциональным эффектам, высокое перфузионное давление в течение длительных периодов времени также усугубляет задержку интерстициальной жидкости в сердечных трансплантатах, что приводит к отеку. Этот отек был частично количественно определен в процентах изменения веса и привел к тому, что сердца с высоким давлением имели статистически более высокий прирост веса по сравнению с сердцами, перфузированными при низком давлении (Рисунок 2C).
Рисунок 1: Настройка перфузионной системы. (A) Общая перфузионная установка. Пунктирные линии показывают порядок, в котором компоненты системы были соединены для оптимизации циркуляции перфузата. Сплошные цветные линии показывают порядок, в котором компоненты были соединены для оптимизации температуры перфузата. (B) Правильный способ работы с сердцем после канюляции, чтобы избежать опорожнения катетера и введения воздуха в коронарные артерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Влияние давления на частоту сердечных сокращений и отек. (A) Частота сердечных сокращений, полученная в результате измерений внутрижелудочкового баллона. Сплошная линия — это медиана экспериментальных групп. Затененная область представляет собой межквартильный диапазон. (B) Площадь под кривой (AUC) данных о частоте сердечных сокращений для каждого часа перфузии. (C) Процент набора веса после 4 ч перфузии при низком и высоком давлении. Все данные выражены в виде медианы ± межквартильного диапазона (МКР). *p < 0,01, **p < 0,05, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Влияние давления на функцию левого желудочка. (A) Максимальное систолическое давление, построенное на графике с течением времени, обозначается как пульсовое давление левого желудочка (LVPP). Сплошная линия — это медиана экспериментальных групп. Затененная область представляет собой межквартильный диапазон. (B) Площадь под кривой LVPP (AUC) для каждого часа перфузии. (C) Сократительная способность сердечной мышцы, определяемая по максимальной производной импульса давления. (D) Расслабление сердечной мышцы, количественно определяемое по минимальной производной импульса давления. Все данные выражены в виде медианы ± межквартильного диапазона. *p < 0,01, **p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Ион | Концентрация (ммоль/л) |
Na+ | 135–145 |
К + | <6.00 |
Ка +2 | 1.0–1.3 |
Кл - | 96–106 |
Таблица 1: Допустимый диапазон концентраций ионов в перфузате.
Перфузия Лангендорфа — это чрезвычайно гибкий метод, который позволяет создавать впечатляющие индивидуальные заказы и корректировки для удовлетворения широкого спектра экспериментальных потребностей. Такая адаптация допускается значительной регулируемостью большинства параметров перфузии, в том числе и перфузионных давлений. Из-за ретроградной природы Лангендорфа перфузионное давление эквивалентно коронарному перфузионному давлению, которое играет важную роль в работе сердца. Известно, что коронарное перфузионное давление (СРТ) непосредственно контролирует сердечную работу, поскольку широкий спектр сердечных индексов (т.е. давление в левом желудочке, сократительная способность (dP/dtmax), напряжение стенки, жесткость желудочков) прямо пропорционален СР 16,17,18. Исторически сложилось так, что в этой области использовалось перфузионное давление и, по сути, CPP, от 60 мм рт.ст. до 80 мм рт.ст. в попытке имитировать физиологические условия 5,8,15,19,20,21. Однако нефизиологичность ретроградной перфузии ex vivo в сочетании с высокой востребованностью работы приводит к потере сердечной функции со временем (рис. 3). С другой стороны, более низкое перфузионное давление (30-35 мм рт.ст.), несмотря на то, что оно не точно воспроизводит физиологические условия сердца крыс in vivo, по своей природе снижает потребность в сердечной работе и обеспечивает более длительное время перфузии (4 ч) без потери функции со временем (Рисунок 3) и уменьшения отека трансплантата (Рисунок 2C). Использование более низкого перфузионного давления, хотя и означает отклонение от физиологического ХТБ, по-видимому, обеспечивает важные преимущества по сравнению с использованием физиологического перфузионного давления, поскольку устранение существующей потери функции, зависящей от техники, во время перфузии Лангендорфа улучшает технику в более точную и предсказуемую модельную систему со значительным потенциалом для продвижения сердечно-сосудистых исследований. В частности, области исследований, которые приносят пользу и/или требуют увеличения времени перфузии для достижения научной значимости (т.е. медикаментозное лечение, анализ иммунологического ответа, редактирование генов, нормотермическое сохранение трансплантатов и т.д.), становятся все более важными в борьбе с ССЗ.
Перфузия Лангендорфа, бесспорно, является важным инструментом в области исследований сердечно-сосудистой системы. Таким образом, наряду со значительными преимуществами, которые этот научный метод представляет для исследовательского сообщества, он имеет важный уровень научной сложности. По сути, в рамках этого протокола есть несколько критических этапов, которые требуют тщательной стандартизации, в первую очередь для предотвращения повреждения сердечного трансплантата до, во время и сразу после начала перфузии. Первый шанс повреждения трансплантата незаметен во время промывания воротной вены. Эта промывка гепаринизированным физиологическим раствором направлена на удаление как можно большего количества цельной крови из сердечного трансплантата с двойной целью. Во-первых, он служит способом эвтаназии через обескровливание. Во-вторых, это сводит к минимуму вероятность свертывания крови в сердечном трансплантате во время извлечения, канюляции и транспортировки, поскольку цельная кровь крысы, как известно, имеет чрезвычайно короткую одеждураз 22,23. Однако после сотен успешных сердечных перфузий стало очевидно, что давление, оказываемое на организм крысы во время промывки, имеет огромное значение, при этом идеальное давление промывки составляет около 10 мм рт.ст. Более высокое давление промывки воротной вены, по-видимому, приводит к повреждению сосудистой сети сердечного трансплантата, что приводит к увеличению сосудистого сопротивления (). Более высокое сосудистое сопротивление приводит к достижению целевого перфузионного давления при более низких скоростях потока. Этот дисбаланс между давлением и коронарным кровотоком отражается в создаваемом пульсовом давлении левого желудочка (ЛЖЖ), что приводит к значительной вариабельности.
Следующий случай возможного повреждения сердечного трансплантата происходит при подключении трансплантата к системе путем введения пузырьков воздуха в коронарные артерии. Пузырьки воздуха могут быть легко занесены при неправильном обращении с канюлированным сердцем (рисунок 1B) или неправильном удалении пузырьков из перфузионной системы перед пузырьковой ловушкой24. Из-за ретроградного характера этой системы, любое введение воздуха приведет к сердечной воздушной эмболии, что приведет к ишемическим повреждениям, фибрилляции и, очень часто, к гибели трансплантата. Наконец, последний критический шаг для обеспечения успеха протокола происходит во время начала перфузии. В отличие от подавляющего большинства рукописей, в которых сообщается об использовании метода Лангендорфа в качестве метода, инициирование перфузии в этом протоколе выполняется при относительно низких потоках (1 мл/мин) с постепенным увеличением (+0,2 мл/мин), что гарантирует полный контроль над давлением перфузии 5,8,15,19,20,21 . Это постепенное увеличение потока и, следовательно, давления имеет решающее значение, поскольку резкие изменения давления необратимо увеличивают сосудистое сопротивление и изменяют хрупкий баланс поток/давление.
Высокое сосудистое сопротивление при перфузиях Лангендорфа с контролируемым давлением имеет большое значение, так как целевое перфузионное давление достигается при более низких потоках, а трансплантаты получаются недостаточно перфузионными. Большая зависимость от этого идеального баланса между потоком и давлением, вероятно, является самым большим ограничением этого протокола, поскольку любое предшествующее повреждение трансплантата, преднамеренное (т.е. длительная холодовая консервация, повреждение теплой ишемии, инфаркт миокарда и т.д.) или непреднамеренное, приводит к увеличению сосудистого сопротивления. По сути, этот протокол особенно полезен для исследований, в которых эксперимент начинается после начала перфузии (т.е. медикаментозного лечения, анализа иммунологического ответа, редактирования генов, нормотермического сохранения трансплантата и т.д.), но не до. Это ограничение является прекрасным примером того, что метод Лангендорфа не подходит для всех целей, и особое внимание следует уделить адаптации параметров перфузии для лучшего удовлетворения экспериментальных потребностей.
SNT имеет патентные заявки, имеющие отношение к этому исследованию, и входит в состав Научно-консультативного совета Sylvatica Biotech Inc., компании, специализирующейся на разработке технологии сохранения органов. Все конкурирующие интересы управляются MGH и Partners HealthCare в соответствии с их политикой в отношении конфликта интересов.
Эта работа была поддержана щедрым финансированием S.N.T. со стороны Национальных институтов здравоохранения США (K99/R00 HL1431149; R01HL157803) и Американской кардиологической ассоциации (18CDA34110049). Мы также выражаем признательность за финансирование со стороны Национального института здравоохранения США (R01DK134590; R24OD034189), Национальный научный фонд (EEC 1941543), стипендия Элеоноры и Майлза Шора Гарвардской медицинской школы, Фонд семьи Польски, премия Клафлина за выдающиеся научные достижения от имени Исполнительного комитета по исследованиям MGH и Детская школа Шрайнерс Бостон (грант #BOS-85115).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
5-0 Suture | Fine Scientific Tools | 18020-50 | |
14 G Angiocath | Becton Dickinson | 381867 | |
16 G Angiocath | Becton Dickinson | 381957 | |
24 mm Heart Chamber adaptors | Radnoti | 140132 | |
Balloon Catheter | Radnoti | 170423 | |
BD Slip Tip Sterile Syringes- 10 mL | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
BD Slip Tip Sterile Syringes- 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
BD Slip Tip Sterile Syringes- 50 mL | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti | 130149 | |
Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
Clamp Holder | United Scientic | RTCLMP1 | |
Dextran | Sigma | 31389 | |
DIN8 Extension Cable | Iworx | SKU C-DIN-EXT | |
Falcon High Clarity 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
GSC Go Science Crazy Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientific | S13748 | |
Heart Chamber | Radnoti | 140160 | |
Heated Water Circulator bath | Cole Parmer | N/A | |
Heparin sodium Injection | Medplus | G-0409-2720-0409-2721 | |
Hydrocortisone | Solu-Cortef | MGH Pharmacy | |
Insulin | Humulin R | MGH Pharmacy | |
Insvasive Fluid Filled Blood Pressure Sensor | Iworx | SKU BP-10x | |
Iworx Data Acquisition System | Iworx | IX-RA-834 | |
Krebs-Henseleit Buffer | Sigma | K3753 | |
Left Ventricular Pressure Balloon | Radnoti | 170404 | |
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head for Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor | VWR | MFLX77200-60 | |
Masterflex L/S Standard Digital Pump Systems | VWR | MFLX07551-30 | |
Membrane Oxygenating Chamber | Radnoti | 130144 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
Polyethylene Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12H | |
Precision Pump Tubing-16 | VWR | MFLX96410-16 | |
Sodium Bicarobonate | Sigma | 5761 | |
Standard PHD ULTRA CP Syringe Pump | Harvard Aparatus | 88-3015 | |
Tygon Transfer Tubing | VWR | MFLX95702-03 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены