Ретиноевая кислота, инкапсулированная катионной наноэмульсией, в качестве адъюванта для стимулирования OVA-специфических системных и слизистых реакций

В этом протоколе мы разработали ретиноевую кислоту (РА), инкапсулированную катионной наноэмульсией, для использования в качестве адъюванта для стимулирования антиген-специфических системных и слизистых реакций. При добавлении одобренного FDA RA в наноэмульсию антиген-специфический sIgA стимулировался во влагалище и тонком кишечнике после внутримышечного введения наноэмульсии.

Катионные наноструктуры появились как адъювант и система доставки антигенов, которая усиливает созревание дендритных клеток, генерацию АФК и поглощение антигена, а затем способствует антиген-специфическим иммунным реакциям. В последние годы все большее внимание уделяется ретиноевой кислоте (РА) из-за ее эффекта в активации иммунного ответа слизистой оболочки; однако для того, чтобы использовать РА в качестве вспомогательного средства слизистой, необходимо решить проблему его растворения, загрузки и доставки. Здесь мы описываем систему доставки катионной наноэмульсии, инкапсулированную ретиноевой кислотой (CNE-RA), состоящую из катионного липида 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (ДОТАП), ретиноевой кислоты, сквалена в качестве масляной фазы, полисорбата 80 в качестве поверхностно-активного вещества и сорбитана триолеата 85 в качестве сопутствующего поверхностно-активного вещества. Его физико-химические свойства были охарактеризованы с помощью динамического рассеяния света и спектрофотометра. Иммунизация мышей смесью антигена (овальбумина, OVA) и CNE-RA значительно повысила уровни анти-OVA секреторного иммуноглобулина А (sIgA) в жидкости для промывания влагалища и жидкости для промывания тонкой кишки мышей по сравнению с одной OVA. В этом протоколе подробно описан метод получения, характеристики и оценки адъювантного эффекта CNE-RA.

Адъюванты часто используются для повышения эффективности вакцины, стимулируя иммунную систему более сильно реагировать на вакцину, тем самым повышая иммунитет к определенному патогену¹. Адъювант наноэмульсии (NE) относится к коллоидной дисперсионной системе с термодинамической стабильностью путем эмульгирования определенной доли масляной фазы и водной фазы с получением эмульсии в форме воды в масле (W/O) или масла в воде (O/W)². Н/В наноэмульсионный адъювант может продуцировать цитокины и хемокины в месте инъекции, индуцировать быструю агрегацию и пролиферацию важных иммунных клеток, таких как моноциты, нейтрофилы и эозинофилы, а также усиливать иммунный ответ и улучшать иммуногенность антигенов³. В настоящее время три наноэмульсионных адъюванта (MF59, AS03 и AF03) лицензированы для использования в вакцинах и показали хорошую безопасность и эффективность⁴.

Тем не менее, иммунитет слизистой оболочки плохо решался с помощью лицензированных в настоящее время адъювантных препаратов в традиционной парентеральной вакцинации^. Сообщалось, что ретиноевая кислота (РА) индуцирует кишечное хоуминг иммунных клеток, но ее низкая полярность, плохая растворимость в воде, а также плохая световая и термическая стабильность ограничивают ее использование для надежной кишечной вакцинации. Наноэмульсии открывают возможности для повышения биодоступности высоколипофильных препаратов, а масляная сердцевина эмульсионных адъювантов подходит для растворения неполярных веществ, таких как RA⁶. Таким образом, наноэмульсии могут быть использованы в качестве носителей РА с целью достижения двойного ответного эффекта системного иммунитета и иммунитета слизистой оболочки.

По сравнению с нейтральными или анионными системами доставки, катионные системы доставки обладают относительно эффективными возможностями инкапсуляции и доставки антигенов, что может повысить иммуногенность антигенов ^7,8,9. Катионный поверхностный заряд различных адъювантных систем важен для их адъювантных эффектов 10,11,12. Катионный заряд является важным фактором в продлении удержания вакцины в месте инъекции, повышении презентации антигена и продлении стимуляции клеточного иммунитета в организме¹².

Основываясь на вышеизложенных соображениях, мы разработали катионную наноэмульсию для эффективной совместной доставки РА и антигенов. Размер частиц и дзета-потенциал наноэмульсии определяли с помощью динамического рассеяния света (DLS), а системные и слизистые иммунные реакции наноэмульсии в сочетании с OVA оценивали путем внутримышечной инъекции¹³.

Эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по использованию и уходу за лабораторными животными и одобрены Комитетом по благополучию и этике лабораторных животных Третьего военно-медицинского университета.

1. Приготовление наноэмульсий (НЭ)

1. Для получения водной фазы растворяют 0,15 г полисорбата 80 в 28,2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) при перемешивании при 40 °C.
2. Для приготовления масляной фазы используют масляную фазу наноэмульсии, показанную в таблице 1. Растворите трилеат сорнитана 85, DOTAP и RA в сквалене при перемешивании при 40 °C.
3. Для приготовления первичной эмульсии М/В перемешивайте масляную фазу с помощью магнитов при 1400 об/мин, медленно добавляя водную воду со скоростью 1 мл/мин. Предварительно эмульгируйте смесь с помощью эмульгатора с большими сдвиговыми усилиями при 30 000 об/мин в течение 6 минут.
4. Для гомогенизации под высоким давлением (HPH) обработайте приготовленную выше первичную эмульсию М/В гомогенизатором высокого давления в течение 12 циклов при давлении 900 бар для получения однородной наноэмульсии в диапазоне 160-190 нм.
5. В конце процесса соберите эмульсию в колбу объемом 50 мл и простерилизуйте эмульсию через фильтрующую мембрану PES 0,2 мкм.
6. Подсоедините колбу к линии Шленка через катетер, вращая трехпозиционный запорный кран, чтобы подключить систему к вакуумной трубке, и включите вакуумный насос, чтобы создать вакуум в колбе. Затем, вращая трехходовой запорный кран, подключите систему к трубке Аргона и заполните ее Аргоном. Повторите этот шаг 3 раза, чтобы убедиться, что колба заполнена аргоном.
7. Замените пробку и запечатайте парафиновой пленкой, заверните колбу в оловянную фольгу и храните при температуре 4 °C.

2. Характеристика наноэмульсий

1. Определение размера частиц и дзета-потенциала
   1. Включите прибор и подождите 30 минут, пока лазерный источник света стабилизируется.
   2. Разбавьте NE в 50 раз сверхчистой водой и добавьте 1 мл образца в соответствующую ячейку для образца.
   3. Чтобы измерить размер частиц, установите температуру 25 °C, в качестве диспергирующей среды выберите воду, а в качестве измерительной ячейки — одноразовую пластиковую посуду. Загружайте образцы и измеряйте автоматически. В качестве окончательного результата укажите среднее значение трех повторных измерений для каждого образца.
   4. Для измерения дзета-потенциала установите температуру на 25 °C. В связи с выбором водной фазы в качестве дисперсионной среды выберите модель Смолуховси, а в качестве измерительной ячейки — свернутую капиллярную ячейку. Загружайте образцы и измеряйте автоматически. В качестве окончательного результата укажите среднее значение трех повторных измерений для каждого образца.
2. Определение скорости инкапсуляции и скорости загрузки препарата
   1. Чтобы определить количество РА, загруженного в НЭ, используйте абсолютный этанол для деэмульгирования и извлечения РА из НЭ. К 5 мкл образца добавить 995 мкл этанола и определить содержание РА в растворе с помощью спектрофотометра при 355 нм. Сравните поглощение со стандартной кривой. Используйте следующее уравнение:
      Инкапсуляция = фактическая нагрузка РА/масса добавленного препарата
      Скорость загрузки препарата = фактическая нагрузка РА / качество образца

3. Процедуры иммунизации и забор образцов

1. Процедура иммунизации и группировка
   1. Группа самок мышей Balb/C в возрасте 6-8 недель и весом примерно 18-21 г в наборах по 5 для иммунизации на 0-й, 14-й день, 28-й день в соответствии со следующими экспериментальными группами: (1) группа PBS, (2) группа овальбумина (OVA), (3) группа OVA+NE-RA (OVA/NE-RA), (4) группа OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA).
   2. Иммунизируйте всех мышей путем внутримышечной инъекции в верхние четырехглавые мышцы 200 мкл различных вакцинных форм: 100 мкл эмульсии и 15 г ОВА, всасываемых в 100 мкл PBS, смешанных перед введением. Введите 100 μл на заднюю ногу. Мышам в контрольной группе назначают только PBS.
   3. Эвтаназия: Усыпьте всех мышей путем внутрибрюшинной инъекции 100 мг/кг 1% пентобарбитала натрия через 2 недели после завершения трех прививок.
   4. Сбор и обработка образцов: После эвтаназии с помощью ножниц разрежьте грудную клетку мышей и вставьте шприц прямо в сердце, чтобы аспирировать примерно 0,5 мл цельной крови. Дайте крови постоять 2 ч при комнатной температуре, а затем центрифугируйте при 1800 х г в течение 5 мин при 4 °C. Соберите сыворотку, аликвоту и храните при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.
   5. Соберите цельную кровь, селезенку, жидкость для промывания влагалища (VLF), жидкость для промывания бронхоальвеол (BALF), жидкость для промывания носа (NLF) и жидкость для промывания тонкой кишки (SILF).
2. Выделение лимфоцитов селезенки
   1. Замочите мышей в этаноле 75% (v/v) для кратковременной стерилизации, переложите мышей на чистую скамью. Разрежьте ножницами кожу на левом животе, обнажите и удалите селезенку.
   2. Поместите селезенку в чашку Петри, содержащую 3 мл PBS, измельчите и отфильтруйте в центрифужную пробирку объемом 15 мл с помощью сита (200 меш, 70 μм) и измельчительного стержня.
   3. Центрифугируйте клетки при 650 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость удалить и суспендировать осадок с 3 мл раствора лизиса эритроцитов, инкубировать при комнатной температуре 5 мин.
   4. Добавьте в пробирку 10 мл PBS и хорошо встряхните, чтобы завершить реакцию, затем центрифугируйте при 650 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
   5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 10 мл PBS, добавьте 20 мкл клеточного разведения в автоматический счетчик клеток для подсчета клеток.
   6. Центрифугируйте клетки при 650 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и разбавьте клетки до 1 x 10⁶ клеток/мл полной средой 1640 (1% пенициллин-стрептомицин, 10% фетальная бычья сыворотка).
3. Сбор VLF: Промыть влагалище 4 раза 75 μл 1% BSA/PBST, смешать раствор для промывания и собрать в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл, центрифугировать при 5000 x g при 4 °C в течение 20 мин, собрать надосадочную жидкость пипеткой и хранить при -80 °C.
4. Коллекция BALF и NLF
   1. Дезинфицируйте мышей после жертвоприношения 75% (v/v) этанола. Держите мышь животом вверх и выпрямите шею. Используйте ножницы, чтобы сделать продольный разрез на коже шеи мыши, и используйте щипцы, чтобы разделить мышцы и адекватно обнажить трахею.
   2. Разрежьте трахею через небольшое поперечное отверстие и вставьте шланг в сторону легких, присоедините шприц к шлангу и введите 0,5 мл PBS в легкие и извлеките, повторите полоскание 3 раза и центрифугируйте при 650 х г при 4 °C в течение 5 мин, храните надосадочную жидкость (BALF) при -80 °C.
   3. Переверните шланг в носовую полость, присоедините шприц к шлангу и введите 0,5 мл PBS, жидкость потечет через носовую полость в центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Отсадите промывку из центрифужной пробирки и повторите полоскание 2 раза, затем центрифугируйте при 650 x g при 4 °C в течение 5 мин, храните надосадочную жидкость (NLF) при -80 °C.
5. Коллекция SILF
   1. В качестве раствора для промывания тонкой кишки приготовьте раствор PBS, содержащий ингибитор трипсина 0,1 мг/мл, 50 мМ/Л ЭДТА-2Na, 1 ммоль/л фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Перемешайте при комнатной температуре, чтобы раствориться, и храните при температуре 4 °C.
   2. Разрежьте тонкую кишку вдоль кишечной трубки и погрузите в 3 мл жидкости для промывания тонкой кишки. Перемешивайте вертикальным встряхиванием при 15 об/мин в течение 30 мин при 4 °C. Центрифугируйте при 1440 x g при 4 °C в течение 20 мин и соберите надосадочную жидкость пипеткой, затем центрифугируйте при 5000 x g при 4 °C в течение 20 мин. Храните надосадочную жидкость (SILF) при температуре -80 °C.

4. Оценка OVA-специфического ответа антител после внутримышечного введения

1. Определение сывороточных уровней IgG, подклассов IgG1, IgG2a и уровней специфических sIgA в VLF, BALF, NLF и SILF с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).
2. Для покрытия антигеном разбавьте OVA до 5 мкг/мл буфером для покрытия и покройте 96-луночные планшеты ИФА в течение ночи при 4 °C 100 мкл раствора OVA на лунку.
3. Планшеты ИФА 5 раз промыть ПБСТ и заблокировать путем инкубации 250 мкл 1% БСА/ПБСТ при 37 °C в течение 2 ч.
4. Планшеты ИФА 5 раз промыть ПБСТ, затем добавить 100 мкл образца, разбавленного, как описано ниже, и инкубировать при 37 °C в течение 1 ч. Разбавьте сыворотку, VLF, BALF, NLF 0,5% BSA/PBST, разбавьте SILF 20% фетальной телячьей сывороткой (FCS)/PBST.
   1. Начните с разбавления сыворотки в 1000 раз, используя двухступенчатую процедуру разведения: разбавьте 20 мкл сыворотки до 1 мл, затем разбавьте 25 мкл этой разбавленной сыворотки до 500 мкл. Используйте это разбавление сыворотки для обнаружения IgG1, IgG2a.
5. Добавьте 200 мкл сыворотки, разбавленной при 1000-кратном увеличении, в первый ряд пластины с покрытием и добавьте 100 мкл 0,5% BSA/PBST во все лунки, кроме первого ряда. Перелейте 100 μL из первого ряда во второй ряд и перемешайте пипеткой 10 раз. Повторите этот шаг до строки 8 и отбросьте 100 мкл жидкости, для обнаружения IgG получена сыворотка различной концентрации.
6. Выполните разведение BALF, NLF и SILF в соотношении 1:1 для обнаружения IgA. Используйте ту же процедуру разведения для VLF, что и для сыворотки.
7. Вымойте пластины ИФА 5 раз с PBST. Добавьте 100 мкл HRP-конъюгированного козьего антимышиного IgG/IgG1/IgG2a/IgA (разбавленного 1:10000 PBST) в соответствующие лунки и инкубируйте при 37 °C в течение 40 мин.
8. Планшеты ИФА 5 раз промыть ПБСТ, добавить 100 μл подложки TMB ELISA (высокочувствительной) и перенести пластину в защищенное от света место на 5 минут. Немедленно добавьте 100 мкл 450 нм стоп-раствора для субстрата TMB, чтобы остановить реакцию.
9. Измерьте абсорбцию (OD) при 450 нм для каждой лунки и рассчитайте титр антител, взяв в качестве положительного значения ответа в 2,1 раза больше сывороточного значения мыши пустой группы.

5. Анализ ELISpot

1. Следуйте рекомендациям по применению ELISpot Plus, для проведения анализов используйте мышиный ИФН-γ (ЩФ) из набора.
2. Извлеките планшет из герметичной упаковки и промойте 4 раза стерильным PBS (200 μл/лунка). Кондиционировать планшет полной средой 1640 (200 мкл/лунка) и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
3. Удалите среду и добавьте в планшет отрегулированную концентрацию суспензии лимфоцитов, приготовленной на шаге 3.2.2 (100 мкл/лунка), затем добавьте 100 мкл стимула, т.е. 1640 полной среды, содержащей 20 мкг/мл OVA257~264 или OVA323~339 или 1640 полной среды. Поместите планшет во влажном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2 на 48 часов. Оберните тарелку алюминиевой фольгой, чтобы избежать испарения.
4. Выбросьте суспензию ячейки и промойте планшет 5 раз PBS (200 μл/лунка). Разбавляют антитело обнаружения (R4-6A2-биотин) до 1 мкг/мл в PBS, содержащем 0,5% сыворотку теленка плода (PBS-0,5% FCS). Добавьте 100 μл в лунку и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре.
5. Мойте тарелку, как в шаге 5.2. Стрептавидин-ЩФ (1:1000) развести в PBS-0,5%FCS и добавить 100 мкл/лунку, инкубировать 1 ч при комнатной температуре.
6. Мойте тарелку, как в шаге 5.2. Отфильтруйте готовый к использованию раствор субстрата (BCIP/NBT-plus) через фильтр 0,45 μм и добавьте 100 μл на лунку. Развиваются до появления отчетливых пятен.
7. Остановите развитие цвета, тщательно промыв водопроводную воду, удалите мягкий пластик и дайте пластине высохнуть.
8. Проверка и подсчет пятен в считывателе ELISpot.

6. Статистический анализ

1. Проанализируйте различия между данными 4 групп с помощью однофакторного ANOVA с последующим множественным сравнением по Тьюки. Выразите все результаты в виде среднего значения ± SD. Значение P менее 0,05 считалось значимым.

В общей сложности было приготовлено четыре наноэмульсионных состава, которые характеризовались размером частиц (рис. 1), дзета-потенциалом и эффективностью инкапсуляции, как показано в таблице 2. Размер частиц был сосредоточен около 160-190 нм, и добавление DOTAP обратило вспять дзета-потенциал наноэмульсии. Специфический для OVA уровень IgG в сыворотке крови и уровень антител к его подгруппе в сыворотке крови были обнаружены через 2 недели после третьей иммунизации. Наноэмульсионная адъювантная вакцина значительно увеличивала титры антител IgG, IgG1 и IgG 2a в сыворотке крови (рис. 2). Что еще более важно, уровни специфических sIgA в жидкости для промывания влагалища и жидкости для лаважа тонкой кишки были значительно повышены при адъюванции OVA с CNE-RA (Рисунок 3). При анализе ELISpot значимых пятен обнаружено не было.

Рисунок 1: Размер, диаметр и распределение. (A) Размер, диаметр и распределение NE-RA. (B) Размер, диаметр и распределение CNE-RA. d.nm - средний диаметр частиц в нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Уровни IgG в сыворотке, специфичной для OVA, и уровни антител к его подгруппе в сыворотке. Уровни IgG в сыворотке OVA и его подгруппах в сыворотке через 2 недели после завершения трех иммунизаций. (A) Значение Log2 титров IgG. (B) Оптическая плотность IgG1 на длине волны 450 нм. (C) Оптическая плотность IgG2a на длине волны 450 нм. Данные выражаются как среднее значение ± SD (n=5), ***: P<0,001. Сравнения различий между группами и группой PBS показаны непосредственно над столбцами на рисунке и обозначены следующим образом: ns: нет значимости, #p<0,05, ###p<0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Специфичный для OVA sIgA. OVA-специфичный sIgA в жидкости для промывания влагалища, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, жидкости для промывания носа, жидкости для промывания тонкой кишки. (A) жидкость для промывания влагалища, (B) жидкость для промывания бронхоальвеол, (C) жидкость для промывания носа и (D) жидкость для промывания тонкой кишки. Данные выражаются в виде среднего значения ± SD (n=5), нс: значимости нет, *p<0,05; p<0.001. Сравнения различий между группами и группой PBS показаны непосредственно над столбцами на рисунке и обозначены следующим образом: ns: нет значимости, ###p<0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Состав масляной фазы НЭ.

Таблица 2: Физико-химические характеристики НЭ.

В этом протоколе мы разработали катионную ретиноевую кислоту, инкапсулированную наноэмульсией, для использования в качестве адъюванта для стимулирования антиген-специфических системных и слизистых реакций. По сравнению с традиционными адъювантами NE он имеет следующие два преимущества. Во-первых, в целом поверхность Н/В НЭ имеет высокий отрицательный заряд, что затрудняет прямую загрузку антигенов. Катионные НЭ могут эффективно адсорбировать пептидные или белковые антигены и усиливать специфическую иммуногенность. Во-вторых, опыт традиционных исследований вакцин показал, что трудно стимулировать ответ слизистой оболочки подкожной или внутримышечной инъекцией5. Путем добавления одобренного FDA RA к наноэмульсии 14,15,16 OVA-специфичный sIgA стимулировался во влагалище и тонкую кишку путем внутримышечной инъекции. Этот протокол не был валидирован на других антигенах, кроме OVA. В будущих исследованиях животные модели заболеваний, связанных с кишечником, могут быть использованы для дальнейшей оценки эффекта и механизма CNE-RA в усилении вакцинной защиты.

Гомогенизация под высоким давлением, сдвиговое смешивание и ультразвук являются наиболее распространенными методами высокоэнергетической эмульгации, используемыми для приготовления НЭ, при этом гомогенизация под высоким давлением обеспечивает наилучшую однородность¹⁷. Однако методы гомогенизации под высоким давлением часто требуют дорогостоящего специализированного оборудования с высокими затратами на подготовку и немалыми проблемами охлаждения¹⁸. В наших предыдущих экспериментах было обнаружено, что давление гомогенизации и количество циклов влияют на размер частиц НЭ, и в определенном диапазоне, чем выше давление гомогенизации и чем больше количество циклов, тем меньше имеет тенденцию быть размер частиц. Приготовление молозива из эмульсии «масло в воде» эффективно преобразует масляную и водную фазы в крупные капли и сокращает количество циклов гомогенизации. Если этот этап не выполнять, увеличение числа циклов гомогенизации может в конечном итоге привести к получению наноэмульсий с тем же размером частиц и дисперсией. Замена PBS в водной фазе 0,9% буфером из физиологического раствора или цитрата натрия не влияла на размер частиц и дисперсию НЭ.

Множественные катионные липиды широко применяются в разработке вакцин¹⁹, DOTAP был выбран из-за того, что он был одобрен для клинического использования, демонстрирует хорошую безопасность и хорошо переносится. Чрезмерный положительный заряд на поверхности СВ может привести к цитотоксичности. По соображениям безопасности при приготовлении катионных НЭ необходимо учитывать тип и количество катионных липидов. Другими катионными липидами, обычно используемыми в исследованиях вакцин, являются DLin-MC3-DMA ((6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконт-6,9,28,31-тетраен-19-ил4-(диметиламино)бутаноат)²⁰, DMG-PEG2000 (1,2-димиристоил-рак-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль-2000), DOTMA (N,N,N-триметил-2,3-бис(октадек-9-ен-1-илокси)пропан-1-аминия хлорид)²¹, DC-Chol (3β- [N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карбамоил]холестерин гидрохлорид)²², и вопрос о том, могут ли они быть использованы для получения катионных НЭ, нуждается в дальнейшем изучении.

В последние годы РА привлек внимание из-за своей способности индуцировать наведение иммунных клеток на слизистую оболочку кишечника по различным путям, однако РА не только плохо растворяется в воде, но и неустойчив к свету и кислороду. При приготовлении и хранении НЭ следует постоянно уделять внимание защите РА от света и кислорода. РА быстро окисляется и разлагается под воздействием света и кислорода, в конечном итоге теряя свой адъювантный эффект.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов в этой работе.

Это исследование было профинансировано ключевой программой Чунцинского фонда естественных наук (No cstc2020jcyj-zdxmX0027) и Китайским национальным фондом естественных наук (No 32270988).