Ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do OVA

Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico (AR) encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Ao adicionar o RA aprovado pela FDA à nanoemulsão, a sIgA específica do antígeno foi promovida na vagina e no intestino delgado após a injeção intramuscular da nanoemulsão.

As nanoestruturas catiônicas surgiram como um adjuvante e sistema de entrega de antígenos que aumenta a maturação das células dendríticas, a geração de ROS e a captação de antígenos e, em seguida, promove respostas imunes específicas do antígeno. Nos últimos anos, o ácido retinóico (AR) tem recebido atenção crescente devido ao seu efeito na ativação da resposta imune da mucosa; no entanto, para usar a AR como adjuvante da mucosa, é necessário resolver o problema de sua dissolução, carregamento e entrega. Aqui, descrevemos um sistema de entrega de ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica (CNE-RA) composto pelo lipídio catiônico 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOTAP), ácido retinóico, esqualeno como fase oleosa, polissorbato 80 como surfactante e trioleato de sorbitano 85 como co-surfactante. Suas propriedades físicas e químicas foram caracterizadas usando espalhamento dinâmico de luz e um espectrofotômetro. A imunização de camundongos com a mistura de antígeno (ovalbumina, OVA) e CNE-RA elevou significativamente os níveis de imunoglobulina A secretora anti-OVA (sIgA) no fluido de lavagem vaginal e no fluido de lavagem do intestino delgado de camundongos em comparação com OVA sozinho. Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação, caracterização e avaliação do efeito adjuvante do CNE-RA.

Os adjuvantes são frequentemente usados para aumentar a eficácia de uma vacina, estimulando o sistema imunológico a responder mais fortemente à vacina, aumentando assim a imunidade a um patógeno específico¹. O adjuvante de nanoemulsão (NE) refere-se a um sistema de dispersão coloidal com estabilidade termodinâmica, emulsificando uma certa proporção da fase oleosa e da fase aquosa para produzir uma emulsão na forma de água em óleo (A/O) ou óleo em água (O/A)². O adjuvante de nanoemulsão O/A pode produzir citocinas e quimiocinas no local da injeção, induzir a rápida agregação e proliferação de células imunes importantes, como monócitos, neutrófilos e eosinófilos, e aumentar a resposta imune e melhorar a imunogenicidade dos antígenos³. Atualmente, três adjuvantes de nanoemulsão (MF59, AS03 e AF03) foram licenciados para uso em vacinas e têm demonstrado boa segurança e eficácia⁴.

No entanto, a imunidade da mucosa tem sido pouco abordada pelas formulações adjuvantes atualmente licenciadas na vacinação parenteral convencional⁵. Foi relatado que o ácido retinóico (AR) induz o homing intestinal das células imunes, mas sua baixa polaridade, baixa solubilidade em água e baixa estabilidade térmica e luminosa limitam seu uso para vacinação entérica robusta. As nanoemulsões oferecem oportunidades para aumentar a biodisponibilidade de medicamentos altamente lipofílicos, e o núcleo de óleo dos adjuvantes de emulsão O/A é adequado para dissolver substâncias apolares, como o RA⁶. Portanto, as nanoemulsões podem ser usadas como carreadores para AR, a fim de alcançar o efeito de resposta dupla da imunidade sistêmica e da imunidade da mucosa.

Em comparação com os sistemas de entrega neutros ou aniônicos, os sistemas de entrega catiônica têm capacidades relativamente eficientes de encapsulamento e entrega de antígenos, o que pode aumentar a imunogenicidade dos antígenos ^7,8,9. A carga de superfície catiônica de uma variedade de sistemas adjuvantes é importante para seus efeitos adjuvantes 10,11,12. A carga catiônica é um fator importante no prolongamento da retenção da vacina no local da injeção, aumentando a apresentação do antígeno e prolongando a estimulação da imunidade celular no organismo¹².

Com base nas considerações acima, desenvolvemos uma nanoemulsão catiônica para co-fornecer efetivamente RA e antígenos. O tamanho de partícula e o potencial zeta da nanoemulsão foram determinados usando espalhamento dinâmico de luz (DLS), e as respostas imunes sistêmicas e mucosas da nanoemulsão combinada com OVA foram avaliadas por injeção intramuscular¹³.

Os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Uso e Cuidados com Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar de Animais de Laboratório da Terceira Universidade Médica Militar.

1. Preparação de nanoemulsões (EN)

1. Para a preparação da fase aquosa, dissolver 0,15 g de polissorbato 80 em 28,2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), agitando a 40 °C.
2. Para a preparação da fase oleosa, use a formulação da fase oleosa da nanoemulsão mostrada na Tabela 1. Dissolver o trileato de sornitano 85, DOTAP e RA em esqualeno, agitando a 40 °C.
3. Para a preparação primária da emulsão O/A, agite a fase oleosa magneticamente a 1400 rpm enquanto adiciona o aquoso lentamente e gota a gota a uma taxa de 1 mL/min. Pré-emulsione a mistura usando um emulsificante de alto cisalhamento a 30.000 rpm por 6 min.
4. Para homogeneização de alta pressão (HPH), trate a emulsão O/A primária preparada acima com um homogeneizador de alta pressão por 12 ciclos a 900 bar para obter uma nanoemulsão homogênea na faixa de 160-190 nm.
5. No final do processo, recolher a emulsão num balão de 50 ml e filtrar-esterilizar a emulsão através de uma membrana filtrante PES de 0,2 μm.
6. Conecte o frasco à Linha Schlenk através do cateter, girando a torneira de três vias para conectar o sistema ao tubo de vácuo e ligue a bomba de vácuo para criar vácuo no frasco. Em seguida, girando a torneira de três vias, conecte o sistema ao tubo de argônio e encha-o com argônio. Repita esta etapa 3x para garantir que o frasco esteja cheio de argônio.
7. Substituir a rolha e selar com uma película de parafina, envolver o balão em folha de estanho e conservá-lo a 4 °C.

2. Caracterização das nanoemulsões

1. Tamanho de partícula e detecção de potencial zeta
   1. Ligue o instrumento e aguarde 30 minutos para que a fonte de luz laser se estabilize.
   2. Dilua o NE 50 vezes com água ultrapura e adicione 1 mL de amostra à célula de amostra correspondente.
   3. Para medir o tamanho das partículas, defina a temperatura para 25 °C, selecione água como meio de dispersão e selecione pratos de plástico descartáveis como célula de medição. Carregue as amostras e meça automaticamente. Relate o valor médio de três medições repetidas para cada amostra como resultado final.
   4. Para medição do potencial zeta, ajuste a temperatura para 25 °C. Devido à escolha da fase aquosa como meio de dispersão, selecione o modelo de Smoluchowsi e a célula capilar dobrada como célula de medição. Carregue as amostras e meça automaticamente. Relate a média de três medições replicadas para cada amostra como resultado final.
2. Determinação da taxa de encapsulamento e taxa de carga de fármacos
   1. Para determinar a quantidade de AR carregada no NE, use etanol absoluto para desemulsionar e extrair o AR do NE. Adicionar 995 μl de etanol a 5 μl de amostra e determinar o teor de AR da solução com um espectrofotómetro a 355 nm. Compare a absorbância com uma curva padrão. Use a seguinte equação:
      Encapsulamento = carga real de AR/peso do medicamento adicionado
      Taxa de carregamento de medicamentos = carregamento real de RA / qualidade da amostra

3. Procedimentos de imunização e coleta de amostras

1. Procedimento e agrupamento de imunização
   1. Agrupe camundongos Balb/C fêmeas com idade entre 6 e 8 semanas e pesando aproximadamente 18-21 g em séries de 5 para imunização no dia 0, dia 14, dia 28 de acordo com os seguintes grupos experimentais: (1) grupo PBS, (2) grupo ovalbumina (OVA), (3) grupo OVA+ NE-RA (OVA/NE-RA), (4) grupo OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA).
   2. Imunizar todos os camundongos por injeção intramuscular nos músculos superiores do quadríceps com 200 μL de diferentes formulações de vacinas: 100 μL de emulsão e 15 μg de OVA absorvidos em 100 μL de PBS, misturados antes da administração. Injetar 100 μL/pata traseira. Para camundongos do grupo controle, administre PBS sozinho.
   3. Eutanásia: Eutanásia de todos os camundongos por uma injeção intraperitoneal de 100 mg / kg de pentobarbital sódico a 1% 2 semanas após a conclusão das três imunizações.
   4. Coleta e processamento de amostras: Após a eutanásia, use uma tesoura para abrir o peito dos camundongos e insira uma seringa diretamente no coração para aspirar aproximadamente 0,5 mL de sangue total. Deixe o sangue repousar por 2 h em temperatura ambiente e, em seguida, centrifugue a 1800 x g por 5 min a 4 ° C. Colher o soro, a alíquota e conservar a -80 °C para análise posterior.
   5. Colete sangue total, baço, fluido de lavagem vaginal (VLF), fluido de lavagem broncoalveolar (BALF), fluido de lavagem nasal (NLF) e fluido de lavagem do intestino delgado (SILF).
2. Isolamento de linfócitos esplênicos
   1. Mergulhe os camundongos em etanol 75% (v / v) para uma breve esterilização, transfira os camundongos para uma bancada limpa. Corte a pele do abdômen esquerdo com uma tesoura, exponha e remova o baço.
   2. Colocar o baço numa placa de Petri contendo 3 ml de PBS, triturar e filtrar para um tubo de centrifugação de 15 ml, utilizando um coador (200 mesh, 70 μm) e uma vareta de moagem.
   3. Centrifugue as células a 650 x g por 5 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e suspenda o precipitado com 3 mL de solução de lise de glóbulos vermelhos, incube em temperatura ambiente por 5 min.
   4. Adicione 10 mL de PBS ao tubo e agite bem para encerrar a reação, depois centrifugue a 650 x g por 5 min em temperatura ambiente.
   5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mL de PBS, adicione 20 μL da diluição celular ao contador de células automatizado para contagem de células.
   6. Centrifugue as células a 650 x g por 5 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e dilua as células para 1 x 10⁶ células / mL com meio completo 1640 (penicilina-estreptomicina, soro bovino fetal a 10%).
3. Coleta de VLF: Enxágue a vagina 4x com 75 μL de 1% BSA / PBST, combine a solução de lavagem e colete em tubos de centrífuga de 1,5 mL, centrifugue a 5000 x g a 4 ° C por 20 min e colete o sobrenadante com uma pipeta e armazene a -80 ° C.
4. Coleção BALF e NLF
   1. Desinfetar os camundongos após o sacrifício com etanol a 75% (v/v). Segure a barriga do mouse para cima e endireite o pescoço. Use uma tesoura para fazer uma incisão longitudinal na pele do pescoço do camundongo e use uma pinça para separar os músculos e expor a traqueia adequadamente.
   2. Corte a traqueia através de uma pequena abertura transversal e insira a mangueira em direção aos pulmões, conecte a seringa à mangueira e injete 0,5 mL de PBS nos pulmões e retire, repita o enxágue 3x e centrifugue a 650 x g a 4 ° C por 5 min, armazene o sobrenadante (BALF) a -80 ° C.
   3. Inverta a mangueira para a cavidade nasal, conecte a seringa à mangueira e injete 0,5 mL de PBS, o líquido fluirá através da cavidade nasal para o tubo de centrífuga de 1,5 mL. Aspirar a lavagem do tubo de centrifugação e repetir o enxaguamento 2x, depois centrifugar a 650 x g a 4 °C durante 5 min, conservar o sobrenadante (NLF) a -80 °C.
5. Coleção SILF
   1. Prepare a solução de PBS contendo 0,1 mg / mL de inibidor de tripsina, 50 mM / L EDTA-2Na, 1 mM / L de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) como solução de lavagem do intestino delgado. Agitar à temperatura ambiente para dissolver e conservar a 4 °C.
   2. Corte o intestino delgado ao longo do tubo intestinal e mergulhe em 3 mL de fluido de lavagem do intestino delgado. Misturar por agitação vertical a 15 rpm durante 30 min a 4 °C. Centrifugar a 1440 x g a 4 °C durante 20 min e recolher o sobrenadante com uma pipeta, depois centrifugar a 5000 x g a 4 °C durante 20 min. Conservar o sobrenadante (SILF) a -80 °C.

4. Avaliação da resposta de anticorpos específicos para OVA após administração intramuscular

1. Determinar os níveis séricos de IgG, subclasses de IgG1, IgG2a e os níveis de sIgA específica em VLF, BALF, NLF e SILF por ensaio imunoenzimático (ELISA).
2. Para o revestimento de antígeno, diluir o OVA a 5 μg/mL com tampão de revestimento e revestir placas ELISA de 96 poços durante a noite a 4 °C com 100 μL de solução OVA por alvéolo.
3. Lave as placas ELISA 5x com PBST e bloqueie por incubação com 250 μL de 1% BSA / PBST a 37 ° C por 2 h.
4. Lavar as placas ELISA 5x com PBST, adicionar 100 μL da amostra diluída conforme descrito abaixo para ser ensaiada e incubar a 37 °C durante 1 h. Soro diluído, VLF, BALF, NLF com 0,5% BSA/PBST, SILF diluído com 20% de soro fetal de bezerro (FCS)/PBST.
   1. Comece diluindo o soro 1000x usando um procedimento de diluição em duas etapas: dilua 20 μL de soro para 1 mL e, em seguida, dilua 25 μL desse soro diluído para 500 μL. Use esta diluição do soro para detecção de IgG1, IgG2a.
5. Adicione 200 μL do soro diluído a 1000x à primeira fileira da placa revestida e adicione 100 μL de BSA/PBST a 0,5% a todos os poços, exceto a primeira fileira. Transfira 100 μL da primeira linha para a segunda linha e misture 10x com a pipeta. Repita esta etapa até a linha 8 e descarte 100 μL de líquido, o soro de diferentes concentrações foi obtido para a detecção de IgG.
6. Realize uma diluição de 1:1 de BALF, NLF e SILF para detectar IgA. Utilizar o mesmo procedimento de diluição para o VLF que para o soro.
7. Lave as placas ELISA 5x com PBST. Adicionar 100 μL de IgG/IgG1/IgG2a/IgA de cabra conjugada com HRP (diluída a 1:10000 com PBST) aos alvéolos apropriados e incubar a 37 °C durante 40 min.
8. Lave as placas ELISA 5x com PBST, adicione 100 μL de substrato TMB ELISA (altamente sensível) e transfira a placa para um local protegido da luz por 5 min. Adicione imediatamente 100 μL de solução de parada de 450 nm para substrato TMB para interromper a reação.
9. Meça a absorbância (OD) a 450 nm para cada alvéolo e calcule o título de anticorpos tomando 2,1 vezes o valor sérico do camundongo do grupo em branco como valor de resposta positiva.

5. Ensaio ELISpot

1. Siga as diretrizes do ELISpot Plus, use o Mouse IFN-γ (ALP) do kit para realizar os ensaios.
2. Remova a placa da embalagem selada e lave 4x com PBS estéril (200 μL/poço). Condicione a placa com meio completo 1640 (200 μL/poço) e incube por 30 min em temperatura ambiente.
3. Remova o meio e adicione a concentração ajustada de suspensão de linfócitos preparada na etapa 3.2.2 (100 μL / poço) à placa e, em seguida, adicione 100 μL do estímulo, ou seja, 1640 meio completo contendo 20 μg / mL OVA257 ~ 264 ou OVA323 ~ 339 ou 1640 meio completo. Coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 h. Enrole o prato com papel alumínio para evitar evaporação.
4. Descarte a suspensão da célula e lave a placa 5x com PBS (200 μL/poço). Dilua o anticorpo de detecção (R4-6A2-biotina) para 1 μg / mL em PBS contendo 0,5% de soro fetal de bezerro (PBS-0,5% FCS). Adicione 100 μL / poço e incube por 2 h em temperatura ambiente.
5. Lave a placa como na etapa 5.2. Diluir a estreptavidina-ALP (1:1000) em PBS-0,5%FCS e adicionar 100 μL/poço, incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
6. Lave a placa como na etapa 5.2. Filtre a solução de substrato pronta para uso (BCIP/NBT-plus) através de um filtro de 0,45 μm e adicione 100 μL/poço. Desenvolva-se até que surjam manchas distintas.
7. Pare o desenvolvimento da cor lavando extensivamente em água da torneira, remova o plástico macio e deixe a placa secar.
8. Inspecione e conte pontos em um leitor ELISpot.

6. Análise estatística

1. Analise as diferenças entre os dados de 4 grupos por ANOVA de uma via seguida de comparação múltipla de Tukey pós-teste. Expresse todos os resultados como média ± DP. Valor de p menor que 0,05 foi considerado significativo.

No total, quatro formulações de nanoemulsão foram preparadas e caracterizadas por seu tamanho de partícula (Figura 1), seu potencial zeta e sua eficiência de encapsulação, conforme apresentado na Tabela 2. O tamanho da partícula foi concentrado em torno de 160-190nm e a adição de DOTAP reverteu o potencial Zeta da nanoemulsão. A IgG sérica específica para OVA e seu nível de anticorpos de subgrupo no soro foram detectados 2 semanas após a terceira imunização. A vacina adjuvante de nanoemulsão aumentou significativamente os títulos de anticorpos IgG, IgG1 e IgG 2a específicos para OVA no soro (Figura 2). Mais importante, os níveis de sIgA específica no fluido de lavagem vaginal e no fluido de lavagem do intestino delgado foram significativamente aumentados quando o OVA foi adjuvante com CNE-RA (Figura 3). No ensaio ELISpot, não foram encontrados pontos significativos.

Figura 1: Tamanho diâmetro e distribuição. (A) Tamanho diâmetro e distribuição de NE-RA. (B) Tamanho diâmetro e distribuição de CNE-RA. d.nm é o diâmetro médio das partículas em nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: IgG sérica específica para OVA e seus níveis de anticorpos de subgrupo no soro. IgG sérica específica para OVA e seus níveis de anticorpos de subgrupo no soro 2 semanas após as três imunizações foram concluídas. (A) Valor Log2 dos títulos de IgG. (B) Densidade óptica IgG1 a 450 nm. (C) Densidade óptica de IgG2a a 450 nm. Os dados são expressos em média ± DP (n=5), ***: P<0,001. As comparações das diferenças entre os grupos e o grupo PBS são mostradas diretamente acima das colunas da figura e são indicadas da seguinte forma: ns: sem significância, #p<0,05, ###p<0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: SIgA específica do OVA. SIgA específica para OVA no líquido de lavagem vaginal, fluido de lavagem broncoalveolar, fluido de lavagem nasal, fluido de lavagem do intestino delgado. (A) Fluido de lavagem vaginal, (B) fluido de lavagem broncoalveolar, (C) Fluido de lavagem nasal e (D) fluido de lavagem do intestino delgado. Os dados são expressos como média ± DP (n=5), ns: sem significância, *p<0,05; p<0,001. As comparações das diferenças entre os grupos e o grupo PBS são mostradas diretamente acima das colunas da figura e são indicadas da seguinte forma: ns: sem significância, ###p<0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Quadro 1: Formulação das EN em fase oleosa.

Quadro 2: Características físico-químicas das EN.

Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Comparado aos adjuvantes NE tradicionais, tem as duas vantagens a seguir. Em primeiro lugar, em geral, a superfície das EN O/A tem uma carga negativa elevada, o que dificulta a carga direta dos antigénios. As EN catiônicas podem efetivamente adsorver antígenos peptídicos ou proteicos e aumentar a imunogenicidade específica. Em segundo lugar, a experiência na pesquisa tradicional de vacinas mostrou que é difícil estimular a resposta da mucosa por injeção subcutânea ou intramuscular⁵. Ao adicionar o RA aprovado pela FDA à nanoemulsão 14,15,16, a sIgA específica do OVA foi promovida na vagina e no intestino delgado por injeção intramuscular. Este protocolo não foi validado em outros antígenos, exceto para OVA. Em estudos futuros, modelos animais de doenças relacionadas ao intestino podem ser usados para avaliar ainda mais o efeito e o mecanismo do CNE-RA no aumento da proteção vacinal.

A homogeneização de alta pressão, a mistura de cisalhamento e a ultrassonografia são os métodos de emulsificação de alta energia mais comuns usados para preparar ENs, com homogeneização de alta pressão proporcionando a melhor homogeneidade¹⁷. No entanto, os métodos de homogeneização de alta pressão geralmente requerem equipamentos especializados caros, com altos custos de preparação e problemas de resfriamento não desprezíveis¹⁸. Em nossos experimentos anteriores, verificou-se que a pressão de homogeneização e o número de ciclos tiveram um efeito sobre o tamanho de partícula das ENs e, dentro de um determinado intervalo, quanto maior a pressão de homogeneização e maior o número de ciclos, menor o tamanho de partícula tende a ser. A preparação do colostro de emulsão óleo em água converte efetivamente as fases oleosa e aquosa em gotículas grandes e reduz o número de ciclos de homogeneização. Se esta etapa for omitida, aumentar o número de ciclos de homogeneização pode eventualmente resultar em nanoemulsões com o mesmo tamanho de partícula e dispersão. A substituição do PBS na fase aquosa por solução salina a 0,9% ou tampão citrato de sódio não teve efeito sobre o tamanho das partículas e a dispersão das ENs.

Múltiplos lipídios catiônicos são amplamente aplicados no projeto de vacinas¹⁹, o DOTAP foi escolhido por ter sido aprovado para uso clínico, mostrar boa segurança e ser bem tolerado. A carga positiva excessiva na superfície NE pode levar à citotoxicidade. Por razões de segurança, o tipo e a quantidade de lípidos catiónicos devem ser tidos em consideração na preparação das EN catiónicas. Outros lipídios catiônicos comumente usados em estudos de vacinas são DLin-MC3-DMA ((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraeno-19-il4-(dimetilamino)butanoato)²⁰, DMG-PEG2000 (1,2-dimiristoil-rac-glicero-3-metoxipolietilenoglicol-2000), DOTMA (N,N,N-trimetil-2,3-bis(octadec-9-en-1-iloxi)propan-1-amônio)²¹, DC-Chol (cloridrato de 3β- [N-(N′,N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol)²²e se podem ser utilizadas para preparar EN catiónicas precisa de ser mais investigada.

Nos últimos anos, a AR tem atraído a atenção devido à sua capacidade de induzir o retorno das células imunes à mucosa intestinal por várias vias, no entanto, a AR não é apenas pouco solúvel em água, mas também instável à luz e ao oxigênio. Durante a preparação e armazenamento das EN, deve ser dada atenção constante à protecção da AR contra a luz e o oxigénio. A AR será rapidamente oxidada e decomposta quando exposta à luz e ao oxigênio, eventualmente perdendo seu efeito adjuvante.

Os autores declaram não ter conflitos de interesse neste trabalho.

Este estudo foi financiado pelo Programa-Chave da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing (nº cstc2020jcyj-zdxmX0027) e pelo Projeto da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32270988).