Термохимические исследования троичных комплексов Ni(II) и Zn(II) с использованием масс-спектрометрии подвижности ионов

В данной статье описывается экспериментальный протокол с использованием электрораспылительно-ионной подвижности-масс-спектрометрии, полуэмпирических квантовых вычислений и пороговой диссоциации, вызванной столкновением с энергетическим разрешением, для измерения относительной термохимии диссоциации родственных троичных металлических комплексов.

В данной статье описывается экспериментальный протокол, использующий электрораспылительно-ионную подвижность-масс-спектрометрию (ES-IM-MS) и пороговую диссоциацию, индуцированную столкновением с энергетическим разрешением (TCID), для измерения термохимии диссоциации отрицательно заряженных [amb+M(II)+NTA]^-троичных комплексов в два канала продукта: [amb+M(II)] + NTA или [NTA+M(II)]^-  + amb, где M = Zn или Ni и NTA — нитрилотриацетовая кислота. Комплексы содержат один из альтернативных гептапептидов связывания металлов (amb) с первичными структурами ацетил-Его_1-Cys 2-Gly_{3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7} или ацетил-Asp_{1-Cys 2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7}, где аминокислоты Aa_1,2,6,7 позиции являются потенциальными металлообвязанными площадками. Оптимизированные для геометрии стационарные состояния троичных комплексов и их продуктов были выбраны из расчетов квантовой химии (в настоящее время полуэмпирический гамильтониан PM6) путем сравнения их электронных энергий и их поперечных сечений столкновений (CCS) с теми, которые измеряются ES-IM-MS. На основе расчетов частоты PM6 молекулярные параметры троичного комплекса и его продуктов моделируют энергозависимые интенсивности двух каналов продукта с использованием конкурентного метода TCID для определения пороговых энергий реакций, которые относятся к энтальпиям диссоциации 0 K (ΔH₀). Статистическая механика тепловых и энтропийных поправок с использованием частот вращения и вибрации PM6 обеспечивает 298 К энтальпий диссоциации (ΔH₂₉₈). Эти методы описывают процедуру EI-IM-MS, которая может определять термохимию и константы равновесия для ряда троичных комплексов ионов металлов.

В этом исследовании описывается новый метод с использованием коммерчески доступного масс-спектрометра подвижности ионов, который позволяет определить относительную термохимию для диссоциации альтернативного комплекса троичных металлов [amb+M(II)+NTA], где M = Zn или Ni и NTA = нитрилотриацетовая кислота (рисунок 1). Эти реакции моделируют диссоциацию амб-меченого рекомбинантного белка, прикрепленного к NTA-иммобилизованному металлу во время иммобилизованной аффинной хроматографии металла (IMAC)^1,2. В качестве примера этот метод описан с использованием гептапептидных меток amb A и H (рисунок 2) (выбран из предыдущих исследований 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ), которые проявляют Zn(II) и Ni(II)-связывающие свойства и, таким образом, имеют потенциальное применение в качестве меток очистки. Однако описанный процесс может быть использован для оценки термохимических энергий в любой металлоорганической системе. Эти пептиды amb имеют металлосвязывающие сайты в позициях Aa_{1-Aa 2} и Aa 6-Aa₇, которые конкурируют с карбоксилатными и аминовыми сайтами NTA. Три центральные аминокислоты amb обеспечивают распорку (Gly₃), шарнир для двух плеч (Pro₄) и взаимодействие π катионов на большие расстояния (Tyr₅).

Общее состояние 1− заряда комплексов [amb+M(II)+NTA]^- определяется состоянием протонации их потенциальных сайтов связывания. Поскольку существует Ni(II) или Zn(II) со степенью окисления 2+, должна быть сеть из трех депротонированных отрицательно заряженных участков. Молекулярное моделирование ^{комплексов} [amb+M(II)+NTA] предсказывает, что это два протона из NTA и один протон из amb (т.е. [amb-H+M(II)+NTA-2H]^-). Каналы продукта содержат ионные виды и нейтральные виды (т.е. [NTA-3H+M(II)]^- + amb или [amb-3H+M(II)]^- + NTA). В рукописи «-3Н» исключено в названиях комплексов, но читатель должен знать, что подразумевается -3Н. Прибор измеряет относительную интенсивность двух видов ионной массы к заряду (м/з). Основным атрибутом анализа ES-IM-MS является то, что он позволяет исследовать реакционную способность конкретного вида m/z, как это использовалось здесь и в предыдущих исследованиях amb ^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}.

Получение термохимических данных для крупных комплексов с использованием диссоциации, вызванной столкновением, представляет значительный интерес^13,14. Методологии, включающие кинетический метод, не способствуют подгонке данных по диапазону энергий и не учитывают среды с множественным столкновением 15,16,17,18. Здесь пороговый метод CID (TCID), разработанный с использованием тандемной масс-спектрометрии с управляемым ионным пучком Арментрутом, Эрвином и Роджерсом, применяется¹⁹ к новой инструментальной платформе ES-IM-MS, использующей направляющие ионов бегущей волны. Метод TCID позволяет проводить относительный термохимический анализ диссоциации троичных комплексов на два их продуктовых канала и включает пороговый закон, описывающий перенос энергии столкновения между поступательной энергией реагента (троичный комплекс в данном исследовании) и инертным целевым газом (в данном случае аргоном). Способ включает интеграцию по внутреннему распределению энергии реагента²⁰, поступательные распределения энергии между реагентом и целевым газом²¹ и распределение общего момента импульса^22,23. Вероятность диссоциации и статистическая коррекция Кинетических сдвигов Райса-Рамспергера-Касселя-Маркуса (RRKM), возникающих в результате ограниченного временного окна для наблюдения продуктов, включены²⁴. Для двух независимых каналов продукта конкурентный метод TCID позволяет одновременно подгонять два конкурирующих канала продукта. Диссоциация комплекса происходит через орбитальное переходное состояние, которое обладает свойствами продуктов, но удерживается вместе замкнутым диполем²⁵. Метод TCID включен в программу²⁶ CRUNCH, и здесь описана работа пользовательского интерфейса для оценки термохимии двух каналов диссоциации троичных [amb+M(II)+NTA]^- комплексов. Программа CRUNCH доступна по запросу разработчиков²⁶.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показан обзор протокола.

1. Подготовка реагентов

1. Приобретите сублимированные пептиды амб (чистотой >98%) и храните их в морозильной камере при температуре −80 °C.
2. Покупайте >99% чистоты цинка(II) нитрата гексагидрата и никеля(II) нитрата гексагидрата.
   ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Гексагидрат нитрата никеля(II) представляет опасность для окружающей среды и здоровья.
3. Приобретите нитрилотриацетовую кислоту, поли-DL-аланиновые полимеры, ацетат аммония сверхчистых/следовых металлов, гидроксид аммония, уксусную кислоту ледникового цвета и ацетонитрил класса ВЭЖХ.

2. Подготовка складских решений

1. Пептид amb стоковый раствор
   1. Готовят водный раствор концентрацией 12,5 мМ амб путем взвешивания 10-20 мг лиофилизированного пептида, используя не менее трех значимых цифр и помещая его в пробирку микроцентрифуги полипропилена объемом 1,7 мл.
   2. Добавьте соответствующий объем деионизированной воды (>17,8 МОм см) в микроцентрифужную трубку. Закройте крышку и хорошо перемешайте с не менее чем 20 инверсиями.
   3. Создайте аликвоты 50 мкл из раствора amb емкостью 12,5 мМ и поместите их в маркированные микроцентрифужные трубки объемом 1,7 мл. Храните складские растворы при температуре −80 °C.
2. Растворы ионов металлов
   1. Готовят водные растворы Zn(II) и Ni(II) концентрацией 12,5 мМ путем взвешивания 10-30 мг гексагидрата нитрата металла, используя не менее трех значимых цифр и помещая его в микроцентрифугу полипропилена объемом 1,7 мл.
   2. Добавьте соответствующее количество воды DI в трубку микроцентрифуги. Закройте крышку и хорошо перемешайте с не менее чем 20 инверсиями. Хранить 50 мкл аликвотных растворов при температуре −80 °C.
3. Решения NTA для ионного запаса
   1. Готовят водный раствор NTA путем взвешивания 10-30 мг NTA, используя не менее трех значимых цифр и помещая его в микроцентрифужную трубку объемом 1,7 мл.
   2. Добавьте соответствующее количество воды DI в NTA в микроцентрифужной трубке для достижения конечной концентрации 12,5 мМ. Закройте крышку и хорошо перемешайте с не менее чем 20 инверсиями. Хранить 50 мкл аликвотных растворов при температуре −80 °C.
4. Растворы ацетата аммония: Взвесьте 30,8 мг ацетата аммония и добавьте к 40 мл воды DI для получения раствора 10 мМ. Отрегулируйте рН раствора ацетата аммония до рН 7,7 с 1 мМ гидроксида аммония.
5. Раствор поли-DL-аланина: Сделайте 1 мл, 1000 частей на миллион раствора поли-DL-аланина (PA), растворив 1,0 мг ПА в воде DI. Комплексно перемешать. Создайте аликвоты объемом 50 мкл и поместите их в индивидуально маркированные микроцентрифужные трубки. Хранить раствор 1 000 ppm при температуре −80 °C.

3. Электрораспылительно-ионная подвижность-масс-спектрометрия (ES-IM-MS) коллизионно-индуцированный анализ диссоциации (CID)

1. Подготовьте инструмент путем очистки впускной трубки ES и металлического капилляра путем введения 500 мкл 0,1 М ледниковой уксусной кислоты, затем 500 мкл гидроксида аммония 0,1 М и, наконец, 500 мкл раствора ацетата аммония рН 7,7.
2. Разжижьте запасной раствор емкостью 12,5 мМ, доведя его до комнатной температуры. Создайте конечную концентрацию 0,125 мМ amb путем проведения двух последовательных разбавлений водой DI. Тщательно перемешайте после каждого разведения.
3. Разжижайте раствор металлоионов толщиной 12,5 мМ, доводя его до комнатной температуры. Создайте конечную концентрацию 0,125 мМ иона металла, сделав два последовательных разбавления водой DI. Тщательно перемешайте после каждого разведения.
4. Сжижение стокового раствора NTA объемом 12,5 мМ. Создайте конечную концентрацию 0,125 мМ NTA, сделав два последовательных разведения водой DI. Тщательно перемешайте после каждого разведения.
5. Чтобы получить образец троичного комплекса объемом 2 мл, добавляют 800 мкл раствора NTA 0,125 мМ и 400 мкл раствора ионов металлов 0,125 в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл и тщательно перемешивают по меньшей мере с 20 инверсиями. Добавьте 400 мкл раствора ацетата аммония (рН 7,7) и 400 мкл раствора 0,125 мМ, тщательно перемешайте по меньшей мере с 20 инверсиями и дайте образцу уравновеситься в течение 10 мин при комнатной температуре.
6. Загрузите образец объемом 2 мл в тупой носовой шприц объемом 2,5 мл и введите образец в ЭС прибора с помощью шприцевого насоса прибора со скоростью 10 мкл/мин.
7. Переведите прибор в отрицательный режим IM-MS. Используйте типичные условия эксплуатации прибора²⁷ для этих экспериментов следующим образом.
   1. Впрыскивайте образец со скоростью потока 10 мкл/мин в капилляр ES, удерживаемый при −2 кВ со скоростью дезинфекции азота 500 л/ч. Установите температуру источника ES и дезинсекции на 130 °C и 263 °C соответственно. Установите колбочки отбора проб и экстракции на 25 В и 3 В соответственно.
   2. Для экспериментов CID используйте анализатор квадрупольной массы для выбора изотопной картины тройного комплекса [amb+M(II)+NTA]^- , используя m/z моноизотопного пика с настройками разрешения низкой массы = 4,5 и высокой массы = 16,5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ионы [amb+M(II)+NTA^] передаются на последовательные три ионных проводника бегущей волны (Т-волны).
   3. Убедитесь, что Т-волна ловушки имеет расход газа аргона 3 мл/мин и давление 2,83 х ^10-2 мбар. Установите энергию столкновения (CE) в ловушку при 5 В, чтобы избежать диссоциации троичного комплекса. Пусть ловушка собирает ионы троичного комплекса перед высвобождением (время высвобождения 200 мкс) их в ионный проводник Т-волны (IM) с помощью ловушки DC смещения 14 В, что сводит диссоциацию комплекса на входе IM к минимуму.
   4. Убедитесь, что ионный направляющий IM имеет давление 0,507 мбар, используя скорость потока сверхчистого буферного газа N₂ 2 20 мл/мин. Разведите Т-волны в IM с высотами от 7 В до 30 В и со скоростями от 290 м/с до 801 м/с для каждой начальной и конечной стреловидности ионной направляющей IM.
   5. Установите поток аргона и давление передающей Т-волны такими же, как у ловушки Т-волны. Трансферная Т-волна использовалась для вызванной столкновением диссоциации троичного [amb+M(II)+NTA]^- комплекса с использованием переноса CE.
8. Выберите изотопную картину m/z отрицательно заряженного [amb+M(II)+NTA]^- комплекса с использованием квадруполя передачи в режиме разрешения.
   1. Определите изотопную картину m/z , открыв программу масс-спектрометрии и выбрав Spectrum. Выберите Инструменты > изотопной модели. Во всплывающем окне перечислите молекулярную формулу комплекса, установите флажок Показать заряженный ион, введите 1 для заряда отрицательного и нажмите OK.
   2. В отображаемом изотопном рисунке комплекса обратите внимание на самый низкий пик массы. В программном обеспечении прибора выберите Настройка > Quad Profile. В открывшемся окне выберите Ручная фиксация и введите массу самого низкого пика изотопного паттерна. Нажмите «Обновить», а затем «Закрыть».
   3. Снова выберите Настройка , а затем щелкните Разрешение Quad. Собирайте спектры отрицательных ионов ES-IM-MS постепенно в диапазоне энергий столкновения передачи, используя продолжительность пробега 5 минут и время сканирования 2 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительный перенос энергий может быть испытан от 26-60 В с интервалом 2 В. Рассмотренный конечный диапазон энергий переноса столкновений должен демонстрировать отсутствие диссоциации троичного комплекса при наименьшей энергии и полную диссоциацию в продукты при самой высокой энергии. Для качественного статистического анализа этот анализ ES-IM-MS должен быть выполнен для каждого тройного комплекса amb не менее 3x разными людьми и в разные дни для определения средних и стандартных отклонений.

4. Анализ поперечного сечения столкновений ES-IM-MS (CCS)

1. Очистите впускную трубку ES и металлический капилляр 500 мкл 0,1 М ледниковой уксусной кислоты, затем 500 мкл гидроксида аммония 0,1 М и, наконец, 500 мкл раствора ацетата аммония рН 7,7.
2. Разжижайте стоковый раствор 1000 ppm PA до комнатной температуры и делайте два последовательных разведения; разбавляют до 100 ppm PA водой DI, а затем разбавляют до 10 ppm PA раствором, разбавляя соотношением 1:1 воды DI и ацетонитрила класса ВЭЖХ.
3. Соберите отрицательные спектры ионов IM-MS образца ПА 10 ppm в течение 10 мин, используя инструментальные условия эксплуатации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока впрыска и условия источника ES были такими же, как и в экспериментах CID (этап 3.). Для измерений CCS квадрупольный анализатор массы находился в неразрешающем режиме и пропускал все ионы на последовательные три Т-волновых ионных проводника. Работа ионных проводников ловушки Т-волны и IM Т-волн была такой же, как и для экспериментов CID. Энергия столкновения переходной Т-волновой ячейки составляла 4 В, чтобы позволить ионам проходить без диссоциации.
4. Подготовьте каждый из троичных комплексов, как описано в шагах 3.2.-3.6.
5. Соберите спектры IM-MS каждого троичного комплекса в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте те же инструментальные условия, что и на шаге 4.3.
6. Соберите отрицательные спектры ионов IM-MS образца ПА 10 ppm в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее время прибытия калибрантов ПА, собранных до и после троичных комплексов АМБ, используется при определении CCS.

5. Анализ данных ES-IM-MS CID

1. Идентификация вида путем сопоставления теоретических изотопных паттернов m/z троичного комплекса и его продуктов с экспериментальными спектрами IM-MS.
   1. Откройте программу масс-спектрометрии и выберите Хроматограмма , чтобы открыть новое окно.
   2. В окне Хроматограмма нажмите на Файл > Открыть , чтобы найти и открыть нужный файл данных IM-MS.
   3. Щелкните правой кнопкой мыши, перетащите указатель мыши по хроматограмме и отпустите. Спектр MS будет отображаться в отдельном окне Spectrum .
   4. В новом окне, отображающем спектры, выберите Инструменты > изотопной модели. Появится небольшое окошко. Введите молекулярную формулу вида amb, установите флажок Показать заряженный ион и введите желаемое состояние заряда. Нажмите OK.
   5. Чтобы отличить все виды в спектре IM-MS, повторите этот процесс в окне Spectrum и запишите их диапазон изотопов m/z .
2. Для троичного комплекса АМБ и его продуктов используйте их диапазон изотопов m/z для их идентификации и извлечения их распределения времени прибытия (ATD).
   1. Откройте программное обеспечение для разделения ионной мобильности и выберите Файл > Открыть , чтобы найти и открыть файл данных.
   2. Щелкните левой кнопкой мыши и перетащите указатель мыши, чтобы увеличить диапазон изотопов m/z троичного комплекса [amb+M(II)+NTA]^-.
   3. С помощью инструмента «Выделение» щелкните левой кнопкой мыши и перетащите указатель мыши, чтобы выбрать конкретный диапазон изотопов для [amb+M(II)+NTA^{], как} определено на шаге 5.1. Нажмите на кнопку Принять текущий выбор .
   4. Чтобы устранить любые случайные виды m/z или фоновый сигнал, используйте инструмент «Выделение» для выбора ATD, связанного с троичным комплексом. Нажмите на кнопку Принять текущий выбор .
   5. Чтобы экспортировать файл ATD в программное обеспечение масс-спектрометрии, перейдите в раздел Файл > Экспорт, а затем щелкните Сохранить время дрейфа. При необходимости переименуйте файл и сохраните его в соответствующей папке.
3. Определение путем интегрирования площади под кривой АТД относительной интенсивности вида.
   1. В окне Хроматограмма откройте сохраненный экспортированный файл из программного обеспечения разделения ионной подвижности. Выберите Обработать, а затем Интегрировать. Используйте настройку амплитуды от пика до пика 20 и нажмите OK.
   2. Запишите интегрированную область, как показано в окне Хроматограмма . Повторите шаги 5.2.2.-5.2.5. для двух продуктов, а именно [NTA+M(II)]^- и [amb+M(II)^]-.
   3. Повторите шаги 5.2.1.-5.3.2. для каждой передачи регистрируемой энергии столкновения.
4. Используйте интегрированные области АТД для троичного комплекса [amb+M(II)+NTA]^- и двух продуктов [NTA+M(II)]^- и [amb+M(II)]^- в каждой точке передачи энергии столкновения для нормализации до относительной процентной шкалы.
   1. Создайте электронную таблицу, введя идентификаторы троичного комплекса и его продуктов и их интегрированных ATD при каждой энергии столкновения.
   2. Для каждой энергии столкновения используйте суммирование интегрированных ATD для [amb+M(II)+NTA]^-, [NTA+M(II)]^- и [amb+M(II)]^- для нормализации их отдельных ATD до относительной процентной шкалы.
   3. Из реплицированных измерений TCID найдите средние и стандартные отклонения каждой точки данных. Преобразуйте энергию столкновения лабораторного кадра (E_lab) в энергию столкновения центра масс (E_cm), используя средние массы газа столкновения аргона (m_Ar) и троичного комплекса (m_complex): E_cm = E_lab (m_Ar)/(m_Ar + m_complex).
      ПРИМЕЧАНИЕ: E_cm представляет собой максимальную энергию от столкновения с газом аргона, которая доступна для диссоциации троичного комплекса.
   4. Постройте среднее и стандартное отклонение индивидуальных процентных интенсивностей [amb+M(II)+NTA]^-, [NTA+M(II)]^- и [amb+M(II)]^- на графике относительной интенсивности (%) по сравнению с энергией столкновения в центре масс (eV), чтобы показать, как относительная интенсивность вида изменяется в зависимости от энергии столкновения.

6. Анализ среднего времени прибытия для определения поперечных сечений столкновения (CCS)

1. Откройте программное обеспечение для разделения подвижности ионов и файл, содержащий спектр IM-MS образца ПА 10 ppm, собранного с энергией столкновения переноса, установленной на уровне 4 В. Извлеките ATD каждого из отдельных отрицательно заряженных видов PA и экспортируйте файлы в программное обеспечение масс-спектрометрии с помощью опции Сохранить время дрейфа (см. шаг 5.2.5.). Повторите для второго файла калибрантов PA.
2. Откройте программное обеспечение разделения ионной подвижности. Используйте File > Open , чтобы открыть один из файлов, содержащих спектры IM-MS троичных комплексов amb, записанных между калибрантами PA. Извлеките ATD каждого из троичных комплексов и экспортируйте их файлы в программное обеспечение масс-спектрометрии с помощью опции Сохранить время дрейфа (см. шаг 5.2.5.).
3. Используйте метод поперечной калибровки²⁸ для расчета CCS троичного комплекса и его продуктов.
   1. В электронной таблице рассчитайте скорректированный CCS (Ω_c) для каждого из отдельных отрицательно заряженных видов PA из их CCS (Ω)^29,30, измеренных в буферном газе гелия³¹, используя уравнение 1, где z = заряд троичного комплекса, e_c = 1,602 x 10⁻¹⁹ C; m_N2 = масса азота (u), а m_ион = масса троичного комплекса²⁸.
       (1)
   2. Найдите время дрейфа (t_D) калибрантов ПА и троичных комплексов, сначала получив среднее время прибытия (t_A) из максимумов соответствующих кривых ATD, а затем применив уравнение 2, где c = коэффициент задержки детектора (1,41 мс; проверьте прибор, так как это может варьироваться между приборами) и m/z = отношение массы к заряду калибранта ПА или тройного комплекса АМБ.
      т_Д =т_А  (2)
   3. Создайте график, построив калибранты PA t_D против Ω_c. Затем, используя уравнение 3, поместите данные с регрессией наименьших квадратов, чтобы найти константы A' и B, где A' корректирует электрическое поле, температуру и давление в приборе, а B исправляет нелинейное поведение устройства T-wave IM.
      Ω_c = A' t_D^B (3)
   4. Используя константы A' и B и значение t_D тройных комплексов amb, вычислите их Ω_c с помощью уравнения 3 и их Ω с помощью уравнения 1. Значения CCS, оцененные этим методом, имеют абсолютные погрешности около 2%²⁹.

7. Вычислительные методы

1. Используйте полуэмпирический метод PM6³² , реализованный в структурном моделировании и вычислительном программном обеспечении³³ , для определения местоположения оптимизированных для геометрии конформеров троичных комплексов [amb+M(II)+NTA]^- , а также пар ионных и нейтральных продуктов: [amb+M(II)]^- + NTA и [NTA+M(II)]^- + amb, наблюдаемых в экспериментах CID. Обратитесь к использованию визуализатора вычислений в Дополнительном файле для получения подробной информации о том, как разрабатывать и отправлять вычисления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящих систем метод PM6 правильно воспроизвел экспериментальные данные, но в целом может быть использован любой метод квантовой химии, который является надежным и вычислительно выполнимым.
2. Выполните оптимизацию геометрии и расчеты частоты на нескольких различных начальных структурах для изучения различных конформаций, состояний протонирования и потенциальных сайтов связывания. Запишите электронные + нулевые энергии каждой из расположенных стационарных точек для каждого из троичных комплексов и их продуктов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стартовые структуры для оптимизации геометрии должны исследовать различные возможные комбинации сайтов связывания и конформационных механизмов. Стартовые конструкции были основаны на ранее расположенных B3LYP³⁴ [amb+M(II)]^- конформерах ^3,4,6. Для [amb+M(II)+NTA^] NTA была позиционирована, чтобы конкурировать с замещающими участками amb в Aa 1-Aa_{2-Aa 6-Aa 7} и карбоксилатным концом для синглетного спинового состояния Zn(II) или триплетного спинового состояния Ni(II).
3. Используйте программу, которая может выполнять точные измерения поперечного сечения столкновений, измеренные в буферном газе гелия (CCS_He), используя атомные координаты из этих квантово-химических расчетов³⁵.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программы, разработанные для расчета точного CCS_He из пептидных структур, расположенных с помощью квантово-химических расчетов, включают MobCal³⁶ и HPCCS^37,38.
4. Выберите конформер с самой низкой энергией, демонстрирующий CCS Леннарда-Джонса_, который согласуется с измеренным IM-MS CCS_He для выбора структур троичных комплексов и продуктов диссоциации для включения в моделирование CRUNCH ниже.

8. Моделирование CRUNCH

1. Создайте текстовый файл в формате, описанном в разделе обсуждения («Формат текстового файла ввода CRUNCH»).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Файл включает следующие столбцы: (−1) энергия столкновения в центре масс (Е _см), (1) среднее значение относительной интенсивности произведения [amb+M(II)]^-, (2) стандартное отклонение [amb+M(II)]^- интенсивность, (3) среднее относительной интенсивности произведения [NTA+M(II)]^- и (4) стандартное отклонение [NTA+M(II)] ^- интенсивность.
2. Смоделируйте E_см-зависимая интенсивность двух реакционных каналов [amb+M(II)+NTA]^-до [amb+M(II)]^- + НТА и [amb+M(II)+НТА]^- до [НТА+М(II)]^- + amb с использованием техники TCID в программе CRUNCH.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вибрационные и вращательные частоты PM6 для троичного комплекса и двух ионных и нейтральных каналов продукта. Используйте средние массы троичного комплекса, газ столкновения аргона, а также ионные и нейтральные продукты. Использование значений из расчетов PM6 или базы данных NIST для поляризуемости (ų) и дипольные моменты (Debye) для нейтральных продуктов.
   1. В главном меню CRUNCH откройте текстовый файл (. GB5), содержащие Е_{см-зависимые} относительные интенсивности продуктов. Ответ Нет на чтение параметров.
   2. В главном меню CRUNCH выберите Моделирование > Задать все параметры. Из параметров реакционной модели выберите параметр Threshold CID по умолчанию, за которым следует RRKM с интеграцией по распределению передачи энергии троичного комплекса²⁰, введите 2 для независимых смоделированных каналов продукта и выберите Рассчитать поперечные сечения. Введите Нет , чтобы любые два канала продукта имели одинаковую ионную массу?
   3. Для продукта No 1 введите столбец [1] для экспериментальных данных [amb+M(II)^]- продукта, столбец [2] для стандартных отклонений [amb+M(II)]^- продукта, столбец [5] для неконвертированного поперечного сечения модели и столбец [6] для запутанного поперечного сечения модели. Введите 0 для остатков подгонки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти номера столбцов соответствуют столбцам во входном файле на шаге 8.1. как описано в обсуждении («Формат текстового файла ввода CRUNCH»).
   4. Для канала продукта No 2 введите колонку [3] для экспериментальных данных продукта [NTA+M(II)]^- продукта, колонку [4] для стандартных отклонений [NTA+M(II)]^- продукта, колонку [7] для неконвертированного поперечного сечения модели и колонку [8] для запутанного поперечного сечения модели. Введите 0 для остатков подгонки.
   5. Для типа неконволютированной модели выберите поперечное сечение 0 К (включая кинетический сдвиг), которое включает статистическую коррекцию кинетических сдвигов RRKM из-за временного окна 50 мкс от ячейки столкновения до детектора TOF¹⁸.
   6. Для вариантов свертки выберите двойной интеграл Тирнана, который включает в себя свертку над поступательным распределением энергии между троичным комплексным ионом и газом столкновения аргона²¹.
   7. Для метода численного интегрирования выберите квадратуру Гаусса с предварительно сохраненными поперечными сечениями, за которой следует число точек интегрирования = 32, число стандартных отклонений = 3,0 и число стандартных отклонений для второго интеграла = 3,0.
   8. Масса троичного комплексного иона (u) считывается автоматически с . текстовый файл GB5, за которым следует масса газа столкновения (39,948 для аргона); использовать значения по умолчанию 0,20 эВ для FWHM ионного пучка и 298,15 К для температуры газа. Программа автоматически считывает минимальную и максимальную энергии столкновения в центре масс с . Текстовый файл GB5; используйте значение по умолчанию для минимального приращения энергии.
   9. Используйте значение по умолчанию для коэффициента масштабирования Sig0, No для разрешения масштабирования отдельных каналов продукта и значения по умолчанию для N и M. Для метода расчета g(i) выберите интегрируемость по ровибрационной плотности состояний, которая включает внутреннее распределение энергии²⁰ троичного комплекса [amb+M(II)+NTA]^-.
   10. Из вариантов ввода молекулярных параметров введите G для считывания файла³³ структурного моделирования с вибрационными и вращательными частотами PM6 троичного комплекса. Ответ Да на вопрос , является ли один из реагентов атомным? Запишите расположение и имя файла моделирования.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Другие варианты ввода вибрационных и вращательных частот включают файл параметров чтения, который будет считывать параметры из текстового файла, или редактировать/вводить константы, что позволяет вручную вводить каждый параметр.
   11. Масштабирование частот с использованием рекомендуемого NIST коэффициента масштабирования PM6 (1,062). Для получения более подробной информации о масштабировании см. обсуждение («коэффициенты масштабирования для вибрационных частот»). Число атомов в троичном комплексе считывается из файла. Ответ Нет , является ли молекула линейной? Введите описание реагентов (например, H+Zn+NTA- + Ar).
   12. Введите 1 для заряда на ионе и 1,664 для поляризуемости газа аргона³⁹. Масса иона и масса мишени относятся к троичному комплексу и аргону соответственно и автоматически считываются с . Текстовый файл GB5. Введите 0 для гармонических колебаний.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие варианты предназначены для выбора различных коэффициентов масштабирования для высоких или низких вибрационных частот. Введите 1,062 для высоких частот и 0,0 для низких частот (см. обсуждение: коэффициенты масштабирования для вибрационных частот). Показаны масштабированные частоты. Выберите 0 , чтобы выбрать Без изменений.
   13. Нажмите Enter, чтобы прочитать константы вращения 1-D и 2-D из файла структурного моделирования³³, введенного на шаге 8.2.10. Выберите значения по умолчанию 0 для обработки затрудненного ротора и 1 для симметрии молекул.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Программа показывает введенные данные; нажмите Enter для параметра Без изменений.
   14. Выберите значение по умолчанию 300 K для температуры реагента. Выберите Интеграция для метода уменьшения плотности массива состояний. Выберите Да , чтобы усечь распределение энергии. Введите 40000 см⁻¹ для максимальной энергии для распределения, 2,0 см⁻¹ для размера бункера и 32 для количества точек распределения энергии.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Нажмите Enter 2x и убедитесь, что усеченный массив 32-pt имеет популяцию >0,9. Если >0,9, введите Нет , чтобы изменить бункеры или коэффициент конденсации. Если <0,9, введите Да и измените максимальную энергию для распределения и/или размер бункера.
   15. В качестве параметров для модели TCID/RRKM выберите Да в поле Изменить, введите 0 для фиксированного времени и 0,000050 с для верхнего предела окна обнаружения. Для используемого прибора это время, необходимое ионам для перемещения от ячейки столкновения переноса к детектору TOF, и рассчитывается с использованием уравнения 2.
   16. Для молекулы, находящейся под напряжением, введите C , чтобы скопировать значения из уже введенных реагентов. Введите −1 для состояния перехода источника (TS), 0 для TS назначения и P для продолжения.
   17. Для канала продукта 1 выберите 1 для одного переходного состояния из параметров канала диссоциации и 0 для none для последовательной диссоциации. Для типа переходного состояния выберите 1 для орбиты.
   18. Выберите G , чтобы прочитать файлы программы моделирования, содержащие параметры вращения и вибрации PM6 для продуктов [amb+M(II)]^- + NTA. Введите Нет для является ли один из видов PSL TS атомарным? Введите расположение и ^{имя файла [} amb+M(II)]-. Используйте 1,062 для масштабных частот, нажмите Enter для числа атомов и введите No для молекулы линейной?
   19. Введите расположение и имя файла моделирования, содержащего вибрационные и вращательные частоты для продукта NTA. Используйте 1,062 для масштабных частот, нажмите Enter для числа атомов и введите No для молекулы линейной? Введите описание орбитальной ТС, например, H+Zn-... НТА.
   20. Введите 1 для заряда [amb+M(II)]^-иона и введите поляризуемость (16,12 ų) и дипольный момент (4,6183 Дебая) NTA. Выберите 0 K для температуры вращения и locked-dipole для обработки орбитального переходного состояния. Введите средние массы (u) [amb+M(II)]^- иона и NTA.
   21. Введите 0 для гармонических колебаний. Введите 1,062 для высоких частот и 0,0 для низких частот. Смотрите раздел обсуждения для получения более подробной информации о частотах масштабирования; показаны масштабированные частоты. Выберите 0 , чтобы выбрать Без изменений. Нажмите клавишу ВВОД, чтобы прочитать 1-D и 2-D вращательные константы из файлов моделирования. Выберите 0 для затрудненных роторов, 1 для симметрии молекул и 1 для реакционного вырождения. Введите параметр Без изменений .
   22. Для канала продукта 2 выберите 1 для одного переходного состояния, 0 для нулевого для последовательной диссоциации и 1 для орбиты для типа переходного состояния.
   23. Выберите G для чтения в файлах моделирования, содержащих параметры вращения и вибрации PM6 для продуктов [NTA+M(II)^] и amb. Введите Нет для является ли один из видов PSL TS атомарным? Запишите расположение и имя ^{файла моделирования} [NTA+M(II)]..
   24. Используйте 1,062 для масштабных частот, нажмите Enter, чтобы прочитать количество атомов, и введите N для линейности молекулы? Запишите расположение и имя файла моделирования amb. Используйте 1,062 для масштабных частот, нажмите Enter для числа атомов и введите N для линейности молекулы?
   25. Введите описание орбитальной ТС (например, NTA+Zn-... H). Введите 1,0 для заряда [NTA+M(II)]^- иона и введите поляризуемость (ų) и дипольный момент (Debye) amb. Выберите 0,0 K для температуры вращения и locked-dipole для обработки орбитального переходного состояния. Введите средние массы (u) продуктов [NTA+M(II^{)] и} amb.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Выходной файл содержит поляризуемость и дипольные моменты amb. Поляризуемость находится в единицах Бора³ и должна быть преобразована в единицы ų.
   26. Введите 0 для гармонических колебаний. Введите 1,062 для высоких частот и 0 для низких частот. Смотрите обсуждение для получения более подробной информации о частотах масштабирования. Показаны масштабированные частоты. Выберите 0, чтобы выбрать Без изменений. Нажмите клавишу ВВОД, чтобы прочитать 1-D и 2-D вращательные константы из файлов моделирования. Выберите 0 для затрудненных роторов, 1 для симметрии молекул и 1 для реакционного вырождения. Введите Без изменений.
   27. Для обработки неактивных 2-D вращений выберите параметры по умолчанию статистического распределения углового момента и интегрируйте P(E,J) над распределением J. Используйте значение по умолчанию 32 в количестве точек интеграции.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эти выборы выбирают метод интеграции по суммарному угловому моменту J уровней^16,17. Полученный вывод позволяет исследователю проверить, что все входные данные верны.
   28. Выберите энергии активации относительно варианта молекулы, находящейся под напряжением , и введите относительную энергию (эВ) для канала продукта 1 , которая близка к пороговой энергии, наблюдаемой на графике относительной интенсивности по отношению к энергии столкновения центра масс продукта [amb+M(II)^]- (рисунок 4).
   29. Для канала продукта 2 введите относительную энергию (эВ), которая близка к пороговой энергии, наблюдаемой на графике интенсивности и энергии столкновения центра ^{масс продукта [} NTA+M(II)].. Чтобы рассчитать количество состояний для каждого канала продукта, используйте размер корзины 2,0. Нажмите клавишу ВВОД, а затем Нет , чтобы продолжить.
   30. В меню Модель выберите Оптимизировать параметры для соответствия данных и введите минимальную энергию и максимальную энергию для начала и завершения подгонки данных соответственно.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте небольшой диапазон энергий, который включает пороговые значения обоих каналов. Для получения дополнительной информации см. обсуждение: диапазон энергий для подгонки выбранной модели TCID к экспериментальным данным.
   31. Выберите -1 для режимов взвешивания экспериментальных стандартных отклонений. На основе полученных данных выберите минимально допустимое отклонение от 0,01 до 0,001. Выберите Нет для оптимизированного масштабирования отдельных каналов и 0 для количества итераций.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой использованию стандартных отклонений является статистический вариант.
   32. Используйте значение по умолчанию для предела сходимости E₀ и выберите No, чтобы сохранить любой параметр в текущем значении. Введите 0,5 и 2,0 эВ для нижнего и верхнего пределов, чтобы избежать сбоя оптимизации, и выберите центральную конечную разность для метода производной оценки. Используйте значение по умолчанию для числовой точности и выберите Нет для изменения размеров производных шагов.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативным методом является выбор Yes для хранения любого параметра в текущем значении. Этот метод описан далее в обсуждении: оптимизация параметров.
   33. В меню Оптимизация выберите Начать оптимизацию. Программа CRUNCH оптимизирует выбранную модель TCID с учетом экспериментальных данных.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если оптимизация не находит удовлетворительных подходов, в меню изменений попробуйте изменить диапазон энергий , чтобы охватить только первые несколько интенсивностей, поднимающихся от пороговых значений. Когда будет найдена разумная посадка, увеличьте диапазон энергии и снова подойдите. Другие варианты, которые могут помочь найти соответствие данным, включают выбор удержания любого параметра при текущем значении в оптимизированных параметрах и изменение вариантов взвешивания в весах. Эти параметры см. в обсуждении.
   34. Когда модель соответствует данным, нажимайте клавишу ВВОД, пока не появится меню Модель . Если только часть энергетического диапазона экспериментальных данных снабжена моделью TCID, выберите Рассчитать и свернуть модель , чтобы расширить модель, подходящую для всех экспериментальных энергий столкновения.
   35. В меню Модель выберите Delta H и S в точке T.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Неконволюционная модель CRUNCH связывает пороговые энергии 0 K с энтальпиями 0 K (ΔH₀) диссоциации троичного комплекса на два независимых канала продукта (таблица 2). 298 K энтальпий (ΔH₂₉₈) и свободные энергии Гиббса (ΔG₂₉₈) диссоциации также получены со статистической механикой тепловых и энтропийных поправок с использованием реагента и продуктов PM6 вращательных и колебательных частот.

Соревновательная коллизионная диссоциация [amb+M(II)+NTA]^- троичных комплексов A и H в [amb+M(II)]^- + NTA или [NTA+M(II)]^- + amb показана на рисунке 3. Amb отображается как A или H , а M = Zn или Ni. Тройной комплекс [A+Zn(II)+NTA]^- (рисунок 3A) демонстрирует кажущиеся пороговые значения, составляющие около 0,7 эВ энергии столкновения (CE) для получения [A+Zn(II)]^- и около 0,9 эВ для получения [NTA+Zn(II)]^-. Диссоциация комплекса [A+Ni(II)+NTA]^- (рисунок 3B) демонстрирует аналогичные пороговые значения (~1,1 эВ) как для [NTA+Ni(II)]^- и [A+Ni(II)]^-, причем [NTA+Ni(II)]^- увеличивается до 90% относительной интенсивности, в то время как интенсивность [A+Ni(II)^{] -} не поднимается выше 18%. Для [H+Zn(II)+NTA]^- троичного комплекса (рисунок 3C) основным продуктом является [H+Zn(II)]^, поднимаясь с порога около 0,6 эВ до примерно 85% относительной интенсивности, а при энергиях выше 1,0 эВ [NTA+Zn(II)] ^- повышается примерно до 30%. Существует также канал для потери воды из [H-H₂O+Zn(II)]^-. Для [H+Ni(II)+NTA]^- (рисунок 3D) [H+Ni(II)]^- повышается с порога около 0,9 эВ до примерно 40% относительной интенсивности, в то время как [NTA+Ni(II)] ^- повышается с ~1,0 эВ до примерно 80%. В графики включен CE, где троичный комплекс на 50% диссоциирован. Троичные комплексы Ni(II) требуют на 0,31-0,37 эВ выше CE, чем их аналоги тройного комплекса Zn(II), чтобы быть диссоциированными на 50%. Это говорит о том, что комплексы Ni(II) более стабильны и требуют более высокого CE для диссоциации, что дополнительно исследуется с использованием метода TCID.

На рисунке 4 показан конкурентный метод TCID, который позволяет одновременно подгонять два конкурирующих канала продукта.

[amb+M(II)+NTA] → [amb+M(II)]^- + NTA (1)

[amb+M(II)+NTA] → [NTA+M(II)]^- + amb (2)

Поверхность потенциальной энергии (PES) иллюстрирует энергетический троичный комплекс, диссоциирующий в конкурирующие каналы продукта, и показывает оптимизированные для геометрии PM6 виды, используемые для моделирования диссоциации [amb_H+Zn(II)+NTA]^-. В ПЭС входят плотность состояний троичного комплекса и сумма состояний продуктов. Пороговые энергии 0 К, Е₁ и Е₂, приравниваются к изменению энтальпии 0 К для реакций 1 и 2.

На рисунке 5 показаны структуры трех других оптимизированных для геометрии троичных комплексов, используемых в этом исследовании. Эти виды были выбраны на основе их предсказанных электронных энергий и энергий нулевой точки и их согласия с измеренными IM-MS поперечными сечениями столкновения (CCS_He). Таблица 1 показывает, что существует соглашение между троичными комплексами LJ CCS_He и экспериментальным IM-MS CCS_He, потому что они согласуются в рамках их взаимной неопределенности. Конформации [amb+M(II)] и amb были основаны на результатах нашего предыдущего DFT-моделирования 3,4,5,6. Молекулярные параметры этих конформеров PM6 были использованы при TCID-моделировании энергоразрешенных диссоциаций троичных комплексов, включая их роколибрационные частоты для расчета их плотности и суммы состояний.

На рисунке 6 показан запутанный порог CRUNCH TCID, соответствующий интенсивности продукта с энергетическим разрешением. Запутанные припадки включают доступные распределения энергии и углового момента реагентов [amb+M(II)+NTA]^- + Ar. Неконволюционные припадки (не показаны) предсказывали изменение энтальпий на 0 К (ΔH₀) для диссоциации троичного комплекса, а в таблице 2 показаны ΔH₀ и ΔH₂₉₈ (кДж/моль) для реакций 1 и 2. Для диссоциации троичных комплексов Zn(II) и A , и H проявляют ΔH₀ для реакции 1, которые на 31 кДж/моль и на 15 кДж/моль ниже, чем ΔH₀ для реакции 2, соответственно, что указывает на то, что и A , и H имеют большее сродство Zn(II), чем NTA. Тройной комплекс [A+Ni(II)+NTA^{] демонстрирует} ΔH₀ = 146 и 148 кДж/моль для реакций 1 и 2 соответственно, что указывает на то, что A и NTA имеют сходные сродства к Ni(II). Однако диссоциация [H+Ni(II)+NTA^{] -} показывает, что ΔH₀ для реакции 1 на 36 кДж/моль ниже, чем для реакции 2, что указывает на то, что H имеет большее сродство Ni(II), чем NTA. В целом, комплексы [amb+Ni(II)+NTA]^- демонстрируют более высокие энтальпии диссоциации, чем их [amb+Zn(II)+NTA]^-аналоги, за исключением A , диссоциирующего на [NTA+Ni(II)^]-. В таблице 3 показаны свободные энергии Гиббса (ΔG₂₉₈) ассоциации и константы образования (K) для обратных реакций:

[amb+M(II)] ^- + NTA → [amb+M(II)+NTA]^- (3)

[НТА+М(II)] ^- + amb → [amb+M(II)+NTA]^- (4)

Таблица 3 показывает, что образование троичных комплексов Ni(II) является более экзергоническим и демонстрирует более крупные константы формирования K , чем комплексы Zn(II) во всех случаях. Реакция 4 (т.е. ассоциация метки amb с комплексом ионов металлов NTA) представляет особый интерес, поскольку она представляет собой помеченный amb рекомбинантный белок, связывающийся с NTA-иммобилизованным ионом металла внутри колонки IMAC. Реакция 4 для образования [amb_A+Ni(II)+NTA] демонстрирует наиболее спонтанный ΔG₂₉₈ = 53,1 кДж/моль и самую высокую константу образования K = 2,01 x 10⁹.

Рисунок 1: Обзор метода ES-IM-MS TCID. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Первичные структуры пептидов amb A и H. Цвет подчеркивает потенциальные места связывания металла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Центр масс, энергетически разрешенный (eV) порог столкновения, вызванный диссоциацией [amb+M(II)+NTA]^-. Показана энергозависимость ионов продукта [amb+M(II)]^- [NTA+M(II)]^- и [amb-H₂O+Zn(II^)]- Энергия столкновения центра масс, где присутствует 50% диссоциация [amb+M(II)+NTA]^- троичного комплекса, включена в графики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Модель для метода TCID с энергетическим разрешением. Столкновения между [amb_H+Zn(II)+NTA]^- + аргоном приводят к диссоциации на [amb_H+Zn(II)]^- + NTA или [NTA+Zn(II)]^- + amb_H произведения. Пороговые энергии E₁ и E₂ приравниваются к 0 K энтальпий диссоциации (ΔH₀) для реакций [amb_H+Zn(II)+NTA]^- → [amb_H+Zn(II)]^- + NTA или [amb_H+Zn(II)+NTA]^- → [NTA+Zn(II)]^- + amb_H, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Оптимизированные по геометрии PM6 троичные [amb+M(II)+NTA] ^- комплексы A и H. Конформеры, используемые в TCID моделировании экспериментальных данных. Эти конформеры были выбраны из других структур-кандидатов путем сравнения их электронных энергий PM6 и того, как их поперечные сечения столкновения ЖЖ (CCS_He) сравнивались с IM-MS, измеренным CCS_He. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Энергоразрешенная, вызванная столкновением диссоциация [amb+M(II)+NTA]^-. Для видов A и H показаны ионы продуктов [amb+M(II)]^- и [NTA+M(II)]^- с запутанным пороговым порогом СЖАТИЯ. Показанные значения энергии (эВ) представляют собой энтальпии диссоциации при 0 К для реакций [amb+M(II)+NTA]^- → [amb+M(II)]^- + NTA или [amb+M(II)+NTA]^- → [NTA+M(II)]^- + amb. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Формат текстового входного файла CRUNCH. Файл содержит средние относительные интенсивности и их стандартные отклонения ионов продукта, образующихся в зависимости от энергии столкновения центра масс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сопоставление поперечных сечений столкновения ЖЖ конформеров PM6 [amb+M(II)+NTA]^-. Теоретические поперечные сечения конформеров PM6 сравниваются с экспериментальным CCS_He , измеренным с помощью ES-IM-MS.

Таблица 2: Термохимические результаты анализов TCID. Энергозависимые реакции [amb+M(II)+NTA]^- → [amb+M(II)]^- + NTA или [amb+M(II)+NTA]^- → [NTA+M(II)]^- + amb, показывающие 0 K энтальпий диссоциации (ΔH₀), полученных из неконволютированной модели TCID, и 298 K энтальпий диссоциации (ΔH₂₉₈), полученных из ΔH₀ и термокоррекций статистической механики с использованием частот вращения и вибрации PM6. Значения приведены в кДж/моль.

Таблица 3: Свободные энергии ассоциации Гиббса (ΔG₂₉₈) и константы формирования равновесия (K). ΔG₂₉₈ и K при 298 K для обратных реакций [amb+M(II)]^- + NTA → [amb+M(II)+NTA]^- и [NTA+M(II)]^- + amb → [amb+M(II)+NTA]^-. Получено из расчета энтропии ΔH₂₉₈ и статистической механики с использованием частот вращения и вибрации PM6. Значения для ΔG₂₉₈ указаны в кДж/моль.

Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Критические шаги
Анализ пороговой диссоциации, вызванной столкновением (TCID) ES-IM-MS. TCID использовал переходную Т-волновую ячейку в присутствии аргона в качестве коллизионной ячейки. До диссоциации ионы-предшественники термулизируются низкоэнергетическими столкновениями с газообразным азотом, когда они проходят через ячейку подвижности ионов (IM). Это приводит к более воспроизводимому TCID с энергетическим разрешением, чем достигается при использовании ловушки в качестве ячейки столкновения ^6,40. Термализация [amb+M(II)+NTA^{] до} диссоциации также позволяет охарактеризовать доступную внутреннюю энергию троичного комплекса с использованием температуры 298 К. Диссоциация в переходной клетке также означает, что троичный комплекс и ионы его продукта имеют одинаковое среднее время прибытия на детектор, что было полезно для идентификации диссоциации троичного комплекса, которая произошла только в клетке переноса. Другими областями, где может произойти диссоциация, являются источник ES (конус отбора проб хранится при 25 В, чтобы избежать этого) или на входе в ячейку IM. Ионы продукта, продуцируемые диссоциацией троичного комплекса в этих областях, имеют различное время дрейфа по сравнению с теми, которые производятся в передаточной ячейке, потому что ионы продукта отделены от троичного комплекса в клетке IM. Эти ионы продукта были исключены из анализа. В этом протоколе для определения их интенсивности используются только интегрированные распределения времени прибытия для ионов прекурсоров и продуктов, которые совпадают. Настройка смещения ловушки - это напряжение, которое контролирует напряжение впрыска в ячейку IM, что способствует CID на входе в ячейку IM. Смещение ловушки было установлено на уровне 14 В, что сводило фоновую диссоциацию к минимуму, не слишком влияя на общую интенсивность. Предыдущее исследование⁴¹ определило эффективную температуру (верхний предел) пептидного димера лейцина энкефалина равным 449 К на входе в im клетку. Однако эффективная температура быстро снижалась по мере того, как димер передавался вниз по ячейке IM. Время прибытия комплексов amb, изученных здесь, продемонстрировало распределения Гаусса, что указывает на то, что они были термализованы, когда они передавались вниз по ячейке IM.

Анализ поперечных сечений столкновений ES-IM-MS (CCS). Время дрейфа CCS было обнаружено экспериментально в результате столкновений с азотом. Эти значения были преобразованы в время дрейфа CCS, полученное из гелия, с использованием калибровочной кривой известных стандартов. Это важно, поскольку программы, используемые для измерения CCS конформеров PM6, требуют более часто используемых стандартов гелия.

Модификации и устранение неисправностей техники
Формат текстового файла ввода CRUNCH. Входной текстовый файл, подходящий для программы CRUNCH, показан на рисунке 7. Заголовки в порядке сверху вниз - это расположение файла и версия CRUNCH; дата; количество энергий; количество рядов данных, исключающих первую колонку энергий; исходный файл; масса комплекса прекурсоров; масса аргона; температура эксперимента; дата создания; x-данные, обозначаемые как −1 (энергии столкновения в центре масс); и полная ширина при половинном максимуме (FWHM) ионного пучка. Эти значения необходимо изменить для каждого эксперимента TCID. Распределение энергии FWHM ионного пучка и нулевой энергии должно быть определено путем анализа потенциала замедления (RPA) путем сканирования CE через низкие напряжения и мониторинга общего тока ионов. Однако в условиях эксплуатации IM в текущем исследовании сигнал ионного тока уменьшался только примерно на 50%, когда передача CE была установлена на самое низкое значение. Нулевая энергия ионного пучка и FWHM могут быть измерены только при дополнительном замедлении путем опускания выходной линзы IM. В этом последнем случае FWHM производной кривой RPA дал типичный разброс энергии ионов 1,5 В в лабораторном кадре или 0,035 эВ в кадре^{центра масс 13}.

Ряд давлений относится к давлению внутри ячейки столкновения, но здесь не используется. Давление аргона в ячейке столкновения может варьироваться, и данные TCID могут быть измерены при трех давлениях для экстраполяции на условия одиночного столкновения. Однако в этом исследовании использовалось только одно давление, и давление приводит к множественным столкновениям. Разработка новой платформы для одного столкновения является областью текущих исследований. Массы относятся к двум ионам продукта, интенсивность которых указана в колонках ниже. Dwells можно оставить по умолчанию. Пять столбцов являются энергиями столкновения в центре масс (обозначены −1); среднее значение интенсивности ионов вида с массой 898,30 u; стандартные отклонения интенсивности ионов вида 898,30 u; среднее значение интенсивности ионов вида массой 253,53 u; и стандартные отклонения интенсивности ионов видов 253,53 u.

Молекулярное моделирование
Первоначально число конформеров было сужено за счет использования моделей, полученных из предыдущих исследований 9,10,11,12,13. Установка CRUNCH требует тщательного скрининга реагентов, активированных молекул и переходных состояний для получения точных пороговых энергий. Предыдущее исследование 9,10,11,12,13 включало обширный скрининг конформеров [amb+M(II)] для получения структур с параметрами, используемыми в моделировании CRUNCH здесь. Использовались только комплексы с транспептидными связями, поскольку только они согласуются с IM-MS измеренным CCS_He¹⁰. Методы молекулярного моделирования B3LYP и PM6 предсказывают конформер с самой низкой энергией [amb+M(II)], который демонстрирует Aa_{1-Cys 2-Cys 7} и карбоксилатную конечную координацию Zn(II) или Ni(II)^10,11,12,13. Знакомство с поведением известных моделей позволило более эффективно определить новых конформеров [amb+M(II)+NTA]. Чтобы помочь в определении конформера, поскольку конформеры с более низкой энергией были обнаружены методом PM6, они систематически отфильтровывались и переоценивались до тех пор, пока не остались наиболее осуществимые конформеры с самой низкой энергией.

Моделирование CRUNCH
Временное окно для наблюдения за диссоциацией. В данном исследовании использовалось временное окно 50 мкс от начала передаточной ячейки до конца анализатора TOF, где расположен многоканальный пластинчатый детектор. Возможно, было бы лучше использовать экспериментальное временное окно между активацией в передаточной ячейке и входом в анализатор массы TOF, потому что, если активированный ион диссоциирует во время своего пребывания в рефлекторном TOF, этот метастабильный распад будет измеряться при другом m/z. Однако в этом исследовании ионы продуктов, наблюдаемые в масс-спектрах, были идентифицированы как немодифицированные виды m/z , показанные на рисунке 3. Это указывает на то, что метастабильный распад не был проблемой. Дальнейшие исследования могут исследовать это, изучая известную реакцию с высоким порогом и проверяя, что правильная пороговая энергия получена с использованием временного окна 50 мкс и моделирования RRKM.

Коэффициенты масштабирования для вибрационных частот. Использовались рекомендуемые NIST коэффициенты масштабирования для вибрационных частот PM6 (1,062). Они были удовлетворительными для соответствия данных [A+Zn(II)+NTA]^-, [A+Ni(II)+NTA]^- и [H+Zn(II)+NTA]^- . Для некоторых случаев, когда канал с более высокой энергией энтропически предпочтительнее канала с более низкой энергией, может потребоваться дополнительное масштабирование частот второго канала. Один из подходов заключается в масштабировании частот ниже 900 см⁻¹ (поскольку они наименее точны), чтобы ослабить частоты и сделать TS более энтропийно предпочтительным.

Оптимизация параметров. Использование параметра Да для хранения любого параметра в текущем значении может быть полезно для успешного соответствия данных. Для первого подгонки удерживается E₀(2), а модель TCID подгоняется к данным путем оптимизации переменных CONST, E₀(1) и N. После того, как хорошая подгонка найдена, опция параметров и Hold любой параметр при текущем значении могут быть использованы для хранения CONST, E₀(1) и N, что позволяет оптимизировать E₀(2) для данных. Наконец, после оптимизации E₀(2) в параметре параметров следует разрешить оптимизацию всех четырех параметров CONST, E₀(1), E₀(2) и N.

Диапазон энергий для подгонки выбранной модели TCID к экспериментальным данным. Диапазон энергий, используемый для соответствия экспериментальным данным, должен воспроизводить как можно больше экспериментальных данных об интенсивности, сохраняя при этом хорошее соответствие в пороговой области. Можно начать с подгонки модели TCID к небольшому энергетическому диапазону на порогах экспериментальных данных. Можно выбрать стартовую энергию, которая демонстрирует фоновую интенсивность непосредственно перед повышением порогового поведения интенсивности. После того, как подгонка TCID оптимизирована для диапазона экспериментальных данных, диапазон должен быть увеличен на 0,1 эВ, а подгонка должна быть оптимизирована снова. Эту процедуру следует повторить, чтобы она соответствовала как можно большему диапазону данных при сохранении соответствия пороговой области.

Термохимические анализы. Термохимические результаты из варианта Delta H и S at T следует сравнивать с серией различных диапазонов энергий, соответствующих данным, чтобы оценить стандартное отклонение соответствия модели TCID. Подходит для сравнения должны включать меньшие диапазоны, которые хорошо соответствуют начальным возрастающим пороговым интенсивностям, с теми, которые имеют большие диапазоны, которые также включают более высокие энергии.

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Этот материал основан на работе, поддерживаемой Национальным научным фондом в рамках 1764436, программы NSF REU (CHE-1659852), инструментальной поддержки NSF (MRI-0821247), физико-астрономической стипендии для успеха (PASS), проекта NSF (1643567), Фонда Уэлча (T-0014) и вычислительных ресурсов Департамента энергетики (TX-W-20090427-0004-50) и L3 Communications. Авторы благодарят Кента М. Эрвина (Университет Невады - Рино) и Питера Б. Арментрута (Университет штата Юта) за то, что они поделились программой CRUNCH и за советы по примерке от PBA. Авторы благодарят группу Майкла Т. Бауэра в Калифорнийском университете в Санта-Барбаре за участие в программе Sigma.