Глубокие и пространственно контролируемые объемные абляции с использованием двухфотонного микроскопа в гаструле рыбок данио

Эмбриональное развитие требует масштабной координации движения клеток. Двухфотонное возбуждение опосредованной лазерной абляцией позволяет осуществлять пространственно управляемую 3-мерную абляцию больших групп глубоких клеток. Кроме того, этот метод может исследовать реакцию коллективно мигрирующих клеток in vivo на возмущения в их механической среде.

Морфогенез включает в себя множество движений клеток для организации клеток в ткани и органы. Для правильного развития все эти движения должны быть тесно скоординированы, и накопленные данные свидетельствуют о том, что это достигается, по крайней мере частично, посредством механических взаимодействий. Тестирование этого на эмбрионе требует прямых физических возмущений. Лазерные абляции являются все более используемым вариантом, который позволяет снять механические ограничения или физически изолировать две клеточные популяции друг от друга. Тем не менее, многие абляции выполняются ультрафиолетовым (УФ) лазером, который предлагает ограниченное осевое разрешение и проникновение в ткани. Здесь описан способ абляции глубоких, значительных и пространственно четко определенных объемов с помощью двухфотонного микроскопа. Абляции демонстрируются в трансгенной линии рыбок данио, экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок в осевой мезендодерме, и используются для разрыва осевой мезендодермы, не затрагивая вышележащую эктодерму или нижележащую желтковую клетку. Поведение клеток контролируется живой визуализацией до и после абляции. Протокол абляции может использоваться на разных стадиях развития, на любом типе клеток или тканей, в масштабах от нескольких микрон до более ста микрон.

Клеточно-клеточные взаимодействия играют жизненно важную роль в развитии. Клетки предоставляют сигналы, которые могут воспринимать их прямые соседи или клетки, находящиеся дальше, тем самым влияя на их судьбу и / или поведение. Многие из этих сигналов носят химический характер. Например, в хорошо охарактеризованных событиях индукции одна группа клеток производит диффузные молекулы, влияющие на судьбу другой клеточной ^{популяции1}. Другие сигналы, однако, являются механическими; клетки оказывают на соседей силы и ограничения, которые соседи воспринимают и на которые ^{реагируют2}.

Одним из способов изучения важности этих клеточно-клеточных взаимодействий in vivo является устранение некоторых клеток и наблюдение за последующим развитием. К сожалению, доступные методы удаления или уничтожения клеток ограничены. Клетки могут быть удалены хирургическим ^{путем3,4} с помощью игл или небольших проводов, но такие методы лечения являются инвазивными, не очень точными и обычно выполняются под стереомикроскопом, предотвращая немедленную визуализацию под микроскопом. Кроме того, нацеливание на глубокие клетки подразумевает прокалывание отверстия в вышележащих тканях, создавая нежелательные возмущения. Генетически закодированные фотосенсибилизаторы, такие как KillerRed, использовались для индуцирования гибели клеток с помощью светового ^{освещения5}. Фотосенсибилизаторы представляют собой хромофоры, которые генерируют активные формы кислорода при световом облучении. Их основным ограничением является то, что они требуют длительного светового освещения (около 15 минут), чего может быть трудно достичь, если клетки движутся, и что они вызывают гибель клеток через апоптоз, который не является немедленным.

Наконец, лазерные абляции были разработаны и широко используются в последние 15 лет6,7,8,9,10,11,12. Лазерный луч фокусируется на целевой клетке/ткани. Он индуцирует его абляцию посредством нагревания, фотоабляции или плазменной абляции; задействованный процесс зависит от плотности мощности и времени ^{экспозиции13}. Большинство протоколов абляции используют УФ-лазеры для их высокой энергии. Однако ультрафиолетовый свет поглощается и рассеивается биологическими тканями. Таким образом, нацеливание на глубокие клетки требует высокой мощности лазера, который затем вызывает повреждения в более поверхностных, внеплановых тканях. Это ограничивает использование УФ-лазеров поверхностными структурами и объясняет их относительно низкое осевое разрешение. Нелинейная оптика (так называемая двухфотонная микроскопия) использует нелинейные свойства света для возбуждения флуорофора двумя фотонами примерно половинной энергии в инфракрасной области. При применении к абляциям это имеет три основных преимущества. Во-первых, инфракрасный свет меньше рассеивается и меньше поглощается биологическими тканями, чем ультрафиолетовый ^свет14, что позволяет достигать более глубоких структур без увеличения необходимой мощности лазера. Во-вторых, использование фемтосекундного импульсного лазера обеспечивает очень высокие плотности мощности, создавая абляцию за счет плазменной индукции, которая, в отличие от нагрева, не диффундирует ^{пространственно15}. В-третьих, плотность мощности, индуцирующая плазмообразование, достигается только в фокальной точке. Благодаря этим свойствам двухфотонная лазерная абляция может быть использована для точного нацеливания на глубокие клетки, не влияя на окружающую среду тканей.

Коллективные миграции являются отличным примером процессов развития, в которых взаимодействие клеток и клеток является фундаментальным. Коллективные миграции определяются как миграции клеток, в которых соседние клетки влияют на поведение одной ^{клетки16}. Природа этих взаимодействий (химических или механических) и то, как они влияют на миграцию клеток, может сильно различаться и часто не совсем понятна. Способность удалять клетки и наблюдать, как это влияет на других, имеет решающее значение для дальнейшего разгадывания этих коллективных процессов. Несколько лет назад мы установили — используя хирургические подходы — что миграция полстера во время гаструляции рыбок данио является коллективной ^{миграцией17}. Полстер представляет собой группу клеток, которые составляют первые интернализующие клетки на дорсальной стороне ^{эмбриона18}. Эти клетки, помеченные зеленым цветом в трансгенной линии Tg(gsc:GFP), расположены глубоко в эмбрионе, ниже нескольких слоев клеток эпибластов. Во время гаструляции эта группа возглавляет расширение осевой мезодермы, мигрируя от эмбрионального органайзера к полюсу животного19,20,21,22,23 (рисунок 1А). Мы установили, что клеткам требуется контакт со своими соседями, чтобы сориентировать свою миграцию в направлении полюса животных. Тем не менее, лучшее понимание клеточных и молекулярных основ этой коллективной миграции включает в себя удаление некоторых клеток, чтобы увидеть, как это влияет на оставшиеся. Поэтому мы разработали абляции больших и глубоких объемов с использованием двухфотонной микроскопической установки. Здесь мы демонстрируем использование этого протокола для разрыва полстера в его середине и наблюдаем последствия миграции клеток путем отслеживания ядер, помеченных Histone2B-mCherry.

Все работы с животными были одобрены Этическим комитетом N 59 и Министерством национального образования, высшего образования и исследований под номером APAFIS#15859-2018051710341011v3. Некоторые из шагов, описанных ниже, специфичны для нашего оборудования и программного обеспечения, но могут быть легко адаптированы к различному оборудованию.

1. Инъекционная подготовка

1. Готовят 75 мл 1% раствора агарозы в эмбриональной среде (ЭМ).
2. Поместите инжекторную форму в чашку Петри толщиной 90 мм и залейте примерно 50 мл агарозы, достаточной для того, чтобы форма всплыла. Дайте агарозе затвердеть и удалите инжекторную форму.
3. Приготовьте блюдо, покрытое агарозой, налив 1 мл агарозы в чашку Петри толщиной 30 мм.
4. Приготовьте 4 мкл 30 нг/мкл раствора мРНК Histone2B-mCherry, разбавляя исходный раствор в воде, не содержащей РНКазы, и держите на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы носить перчатки при манипулировании мРНК, чтобы избежать деградации, опосредованной RNase.
5. Вытяните инъекционную иглу из капилляра с помощью съемника микропипетки.

2. Подготовка эмбрионов

1. После того, как рыбы отложили яйца, соберите, промойте и соберите урожай в 90-миллиметровой чашке Петри в ЭМ. Поместите эмбрионы в инкубатор при температуре 28,5 °C.
2. Подождите 20 минут, пока первая клетка станет видимой.
3. Перенесите 30 эмбрионов на инъекционную пластину, заполненную ЭМ. Выдавите эмбрионы в бороздки с помощью слегка тупых щипцов и ориентируйте их с поднятым вверх полюсом животного.
4. Используя наконечник микрозагрузчика, заполните инъекционную иглу 2 мкл раствора мРНК. Вставьте иглу в капиллярный держатель, помещенный в микроманипулятор, соединенный с трубкой из политетрафторэтилена (PTFE), с воздушным инжектором.
5. Под стереомикроскопом осторожно разбейте кончик иглы.
6. Вводят раствор мРНК в эмбрионы 1-клеточной стадии, вставляя иглу в клетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вводимый объем составляет примерно одну треть объема клетки.
7. Поместите обратно введенные эмбрионы в инкубатор при температуре 28,5 °C.

3. Подготовка двухфотонного микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются два лазера. Один из них используется для изображения GFP (при 920 нм) и выполнения абляций (при 820 нм). Он будет называться зеленым / абляционным лазером. Другой используется при 1160 нм для изображения mCherry. Он будет называться красным лазером.

1. Установите зеленый/абляционный лазер на 820 нм (длина волны абляции), а красный лазер на 1160 нм (возбуждение мВечерри).
2. Используя подвижные зеркала на оптическом пути, выровняйте зеленый/абляционный и красный лазерные лучи как на входе, так и на выходе из сканирующей головки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это увеличивает фокус лазерного луча и минимизирует фокусный объем для возбуждения и абляции.
3. Измерьте максимальную мощность зеленого/абляционного лазера при 820 нм под объективом. Для этого поместите измеритель мощности под объектив, закройте черную камеру, установите мощность зеленого / абляционного лазера на 100% и откройте жалюзи. Рассчитайте процент мощности лазера, необходимый для достижения 300 мВт.
4. Установите зеленый / абляционный лазер до 920 нм (возбуждение GFP) и установите мощность лазера на 7%. Установите мощность красного лазера на 15%.
5. Активация детекторов epi-PhotoMultiplier Tubes (PMT) для зеленых и красных линий; установите чувствительность зеленой и красной линии PMT на 65.
6. Установите поле зрения на 400 x 400 мкм, разрешение изображения на 512 x 512 пикселей и частоту сканирования на 800 Гц.
7. Выберите режим 3D Timelapse Imaging . Затем создайте папку и активируйте автосохранение для данных после каждого сбора.
8. Соберите нагревательную камеру и установите ее на 28 °C. Подождите не менее 10 минут, пока камера и объектив согреются.

4. Монтаж эмбриона

1. С помощью флуоресцентного стереомикроскопа идентифицируйте эмбрионы на 70% эпиболии, которые экспрессируют GFP.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите эмбрионы с ярким сигналом в осевой мезодерме и без фоновой флуоресценции для лучшего качества изображения.
2. Перенесите три-четыре отобранных эмбриона в блюдо, покрытое агарозой (этап 1.3), с помощью пластиковой пипетки Пастера и аккуратно дехорионируйте их с помощью тонких щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дехорионированные эмбрионы очень деликатны и лопаются при контакте с воздухом или пластиком.
3. Влить 1 мл 0,2% агарозы в 1x пенициллин-стрептомицин ЭМ в небольшой стеклянный флакон. Поместите флакон в предварительно нагретый 42 °C сухой блочный нагреватель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены быстро, чтобы обеспечить ориентацию эмбриона до наборов агарозы.
4. Перенесите дехорионированный эмбрион в флакон с 0,2% агарозным стеклом с помощью огнеполированной стеклянной пипетки. Позаботьтесь о том, чтобы не добавлять слишком много ЭМ в агарозу, чтобы избежать ее разбавления. Выбросьте оставшуюся ЭМ из пипетки и аспирируйте эмбрион обратно вместе с достаточным количеством агарозы, чтобы покрыть слайд стеклянной нижней тарелки, прежде чем эмбрион выпадет из пипетки.
5. Выдуйте агарозу и эмбрион на стеклянную горку блюда. Позаботьтесь о том, чтобы эмбрион не коснулся воздуха или пластиковой стороны тарелки. Далее заполните камеру вокруг стеклянной горки агарозой.
6. Используйте ресницу, чтобы сориентировать эмбрион так, чтобы целевая область находилась вверху (рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При ориентации эмбрионов позаботьтесь о том, чтобы коснуться только бластодермы, а не очень хрупкого желтка. Агароз устанавливается примерно через 1 минуту, в зависимости от комнатной температуры.
7. Подождите ~5 мин, пока агароза полностью сложится, а затем добавьте несколько капель пенициллин-стрептомицина ЭМ.

5. Определение местонахождения эмбриона и предабляционная визуализация

1. Поместите стеклянную нижнюю посуду под объектив в нагретую камеру. Погрузите объектив в пенициллин-стрептомицин ЭМ и закройте нагреваемую камеру.
2. Переместите ползунок, чтобы задать световой контур на окуляры. Затем, используя окуляры, люминесцентные лампы и сценический контроль, найдите эмбрион и установите фокус на поверхность эмбриона.
3. Выключите люминесцентную лампу, установите световой путь к PMT и закройте черную камеру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы выключить все источники света в черной камере, так как это может повредить PMT.
4. Запустите визуализацию в реальном времени и найдите осевую мезодерму. Отрегулируйте мощность зеленого / абляционного и красного лазера, чтобы иметь хороший сигнал (т. Е. От 1000 до 20000 фотонов на пиксель для областей экспрессии GFP). Используйте красный канал, чтобы переместить стадию в самый верх эмбриона и установить это положение как Z = 0.
5. Выберите временной шаг 1 мин и Z-шаг 2 мкм. Z-курс 110 мкм достаточен для охвата всего полстера и приобретается менее чем за 1 мин с этими настройками. Установите первый срез на 15 мкм выше осевой мезодермы (в более поверхностной эктодерме).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полстер движется вдоль изогнутой линии так, что нижний срез Z-стека должен быть установлен на 30 мкм глубже, чем самое глубокое положение полстера, чтобы приспособиться к его движению во время покадровой визуализации (рисунок 1E).
6. Запись 10-15 минут предварительного абляционного фильма.

Рисунок 1: Успешный исход лазерной абляции. (А) Схема гаструлирующего эмбриона при 70% эпиболии в дорсальном виде; pAM: задняя осевая мезодерма; черная стрелка отмечает направление миграции полстеров; черный квадрат указывает на типичное поле зрения для абляций в полстере. (B) Схема крепления эмбриона для разрыва полстера. Боковой вид. Эмбрион смонтирован таким образом, что плоскость полстера перпендикулярна оптической оси. (C) выживаемость и (D) морфология контрольных и абляционных эмбрионов через 24 ч после оплодотворения. Шкала бара составляет 300 мкм. (E) Временная последовательность от лазерной абляции в полстере эмбриона Tg(gsc:GFP), экспрессирующего Histone2B-mCherry. Виды только с зеленым каналом являются максимальными проекциями. Крупный план отображает абляционную область, содержащую клеточный мусор. Виды с зеленым и красным (отображается как пурпурный) каналами представляют собой срезы XY и XZ до и после абляции (зеленая молния представляет абляцию). Срезы XZ показывают, что вышележащие ткани (пурпурные ядра без экспрессии GFP) не были затронуты абляцией нижележащих структур. Желтая пунктирная рамка соответствует ROI, выбранному для лазерной абляции. Шкала составляет 50 мкм на больших снимках и 25 мкм на крупном плане. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Определение местоположения цели и лазерная абляция

1. Найдите контур полстера на изображениях в реальном времени и с помощью инструмента «Область интереса электрооптического модулятора» (EOM ROI) нарисуйте большой прямоугольник размером 20 пикселей (15 мкм), охватывающий ширину полстера. Поместите этот прямоугольник в середину полстера (рисунок 1E).
2. Обратите внимание на осевое положение самой высокой и самой низкой плоскостей, содержащих ячейки полстера. Абляции будут выполняться каждые 10 мкм между этими двумя плоскостями. Позаботьтесь о том, чтобы ROI не перекрывал желтковую ячейку ни на одной из этих плоскостей.
3. Поместите сцену в самое низкое положение Z интервала. Абляции должны выполняться снизу вверх, так как мусор поглощает свет.
4. Установите длину волны зеленого/абляционного лазера на 820 нм и установите процент мощности , чтобы получить выходную мощность 300 мВт (шаг 3.3).
5. Установите частоту изображения на 200 Гц.
6. Установите для параметра EOM зеленой/абляционной лазерной визуализации значение 0 и выберите режим ROI-Treatment .
7. Включите EOM и настройте процедуру на немедленное начало (после 0 кадров).
8. Установите для режима обработки изображений значение Timelapse и отмените активацию автосохранения.
9. Установите шаг времени в быстрый режим.
10. Установите для параметров Количество кадров обработки и Число кадров значение, соответствующее заданной глубине (таблица 1).

Таблица 1: Предлагаемое количество рамок лазерной обработки в зависимости от глубины целевой клетки в эмбрионе (0 является поверхностью эмбриона).

11. Запустите создание образа. Приобретение черное, так как затвор PMT закрывается во время обработки EOM.
12. Поднимитесь по сцене на следующую позицию Z списка (шаг 6.2).
13. Повторяйте шаги с 6.10 по 6.12 до тех пор, пока не будет достигнута верхняя часть полстера.

7. Постабляционная верификация и визуализация

1. Установите зеленый/ абляционный лазер на 920 нм и мощность 5%. Установите EOM зеленой/абляционной лазерной визуализации на 100 и выберите режим Fullfield .
2. Установите для параметра Частота изображения значение 800 Гц. Выключите EOM.
3. Пройдите через весь стек в режиме реального времени, чтобы проверить, был ли удален каждый самолет. Если это не так, вернитесь к шагу 6.2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Абляция иногда вызывает вертикальное смещение соседних тканей, так что Z-стек, возможно, придется переопределить.
4. Установите для режима обработки изображений значение 3D Timelapse и повторно активируйте автосохранение. Запись 40-60 минут постабляционного фильма.
5. Проверьте, в постабляционном фильме, были ли целевые клетки эффективно абляции. Восстановление флуоресценции или целевые клетки, занимающие пространство и препятствующие прохождению последующих клеток, указывают на то, что целевые клетки были только фотоотбелены, а не абляции (рисунок 1E и рисунок 2A).

Рисунок 2: Отрицательные результаты лазерной абляции. (А) Типичные примеры потенциальных сбоев в лазерной абляции. Большие XY-виды - это максимальные проекции, вид XZ - реконструированный раздел. Обработанная лазером область расположена между двумя белыми наконечниками стрел. Три фокальные плоскости выделены в реконструированном разделе и отображены справа. Они соответствуют трем различным видам отказов. Плоскость 1 показывает, что клетки над полстером были удалены. Это можно определить по наличию автофлуоресцентного мусора на этой фокальной плоскости (см. крупный план) над полстером (см. положение плоскости 1 на реконструированном участке). Это, вероятно, является результатом неправильного определения региона, подлежащего удалению. Плоскость 2 показывает клетки, которые были отбелены, но не абляции. Они могут быть идентифицированы как сигнал низкой флуоресценции, все еще выявляющий неповрежденные контуры клеток (см. крупный план). Плоскость 3 отображает неповрежденные клетки, которые практически не отбеливались лазерной обработкой. Это может быть результатом неправильного определения региона, подлежащего удалению, или плохого обращения. В ситуациях, изображенных в плоскостях 2 и 3, возможно повторное применение абляционного лечения к неаблированным клеткам-мишеням. Шкала составляет 50 мкм на больших снимках и 20 мкм на крупных планах. (B) Типичный пример пузырьков (отмеченных белыми звездочками), образованных кавитацией из-за слишком интенсивной лазерной обработки. Такие пузырьки не ограничиваются Z-плоскостью, иногда даже охватывая всю высоту полстера, деформируя соседние ткани. Шкала составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

8. Анализ данных

1. Откройте покадровую серию с помощью программного обеспечения для анализа изображений и установите правильный размер пикселя.
2. В функции Spot установите для параметра Размер объекта значение 10 мкм, так как это средний размер ядра во время гаструляции. Затем запустите функцию Spot для обнаружения и отслеживания ядер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение может быть немного улучшено, если учесть более низкое осевое разрешение, устанавливающее эллипсоидальную форму длиной 12 мкм вдоль оси Z.
3. Используйте фильтры для удаления ложных срабатываний. В линии Tg(Gsc:GFP) клетки эмбриональной оси и некоторые энтодермальные клетки помечены зеленым цветом. Следовательно, фильтрация по зеленой интенсивности позволяет быстро выбирать эти ячейки (рисунок 3A).
4. Установите максимальное расстояние между последовательными точками на значение, совместимое со скоростью ячеек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, учитывая временной интервал между двумя кадрами. Клетки Полстера мигрируют со скоростью 2,8 ± 0,8 мкм/мин. Следовательно, разрешение максимального смещения 4 мкм в течение временного шага в 1 мин удаляет большинство артефактных следов.
5. Разрешение разрывов в одной или двух временных точках обеспечивает более длинные непрерывные треки, но может привести к ошибкам отслеживания. Если ядро не обнаружено правильно в одноразовой момент, рассмотрите возможность повторного запуска точечного обнаружения с другими параметрами / фильтрами.
6. Визуально проверяйте треки и при необходимости исправляйте их.
7. Экспортируйте результаты в виде файла .xlsx. Обработайте файл с помощью опубликованных процедур электронных ^{таблиц24} (рисунок 3B) и пользовательских процедур в программном обеспечении для анализа данных (доступно по запросу).

Рисунок 3: Выделение передней половины полстера влияет на направленность клеток. (A) 3D-реконструкция эмбриона Tg(gsc:GFP), экспрессирующего Histone2B-mCherry (отображается в пурпурном цвете), до и после лазерной абляции, разрывающей полстер в его середине. Ядра, принадлежащие передней половине полстера, помечены пурпурной точкой и отслеживаются с течением времени до и после абляции (см. Фильм S1). Шкала шкалы составляет 50 мкм. (B) Как мера стойкости миграции, направление автокорреляции клеток, принадлежащих передней части полстера до и после абляции. Клетки демонстрируют непрерывное движение перед абляцией, которое резко уменьшается после абляции, что указывает на потерю коллективно-ориентированной миграции. Направленная автокорреляция также измерялась на клетках, образующих переднюю половину полстера неабляционного эмбриона, в качестве контроля. Конверты графика указывают на стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Чтобы разорвать полстер в его середине, эмбрион Tg(gsc: GFP), введенный с мРНК Histone2B-mCherry, был установлен на стадии 70% эпиболии, как описано на этапе 4. Полстер был идентифицирован экспрессией GFP, и эмбрион был смонтирован так, что плоскость полстера перпендикулярна оптической оси (рисунок 1B). Наклон эмбриона в сторону от этого положения усложнит процедуру. Свет должен будет пройти через больше тканей, чтобы достичь плоскостей абляции, а плоскости абляции будут наклонены относительно эмбриональных осей. Убедившись, что все клеточные ядра правильно помечены, был записан 10-минутный промежуток времени предварительной абляции для захвата движений клеток перед абляцией (рисунок 1E и рисунок 3A, фильм S1).

Полстер был морфологически идентифицирован, и прямоугольная область 15 мкм х 200 мкм, расположенная в его середине, была удалена на пяти фокальных плоскостях, чтобы обеспечить разрыв на всей глубине полстера (рисунок 1E, фильм S1). Визуализация была возобновлена сразу после абляции и использовалась для мониторинга эффективности процедуры. В случае успеха абляция устранит все клеточные структуры и флуоресценцию GFP и mCherry, так что абляционный объем должен выглядеть как объем без сигнала. Тем не менее, некоторые обломки могут быть созданы. Этот мусор является автофлуоресцентным, как в зеленом, так и в красном каналах, и обычно отображает неправильные вытянутые формы, параллельные направлению абляции (рисунок 1E). Слишком интенсивное лечение приведет к образованию большого количества мусора, который может выступать в качестве препятствия и нарушать поведение клеток. Более сильные методы лечения даже вызовут кавитацию, отмеченную образованием пузырьков в ткани (рисунок 2B). Кавитация связана с механической ударной волной, распространяющейся в тканях, и может вызвать повреждения целевого ^{объема13,15}. Эмбрионы с кавитационными пузырьками должны быть отброшены, а лечение должно быть настроено путем выполнения меньшего количества рамок лечения.

И наоборот, слишком малое лечение может фотоотбеливать флуорофоры, не вызывая образования плазмы, следовательно, без абляции (рисунок 2А). Неполное фотоотбеливание можно легко заметить по наличию тусклой флуоресценции с характерной клеточной формой (рисунок 2А). Такие эмбрионы должны быть выброшены или обработаны снова, выполняя больше рамок лечения. Полное фотоотбеливание сложнее отличить от успешной абляции, так как и то, и другое приведет к громкости без сигнала. Фотоотбеливание, однако, может быть идентифицировано ретроспективно, поскольку флуоресценция будет постепенно восстанавливаться в ходе постабляционной визуализации. Это, однако, означает, что неаблированные эмбрионы визуализируются в течение как минимум получаса, что отнимает много времени. Поэтому мы предлагаем скорректировать интенсивность лечения (путем увеличения количества процедур), чтобы вызвать образование нескольких видимых обломков, которые не повлияют на поведение клеток, но сразу же подтвердят эффективную абляцию. Наконец, отсутствие повреждений в клетках, окружающих объем абляции, следует проверить на первых постабляционных изображениях (рисунок 2А). Когда лазерное лечение настроено правильно (образование небольшого количества мусора), повреждения в соседних тканях вряд ли являются результатом пространственного распространения абляции, которое очень хорошо пространственно определено, а скорее результатом неточного выбора области, подлежащей абляции, и / или движений тканей во времени между выбором цели и абляцией. Эмбрионы с пораженными соседними тканями следует выбросить.

После успешной абляции Z-стеки захватывались каждую минуту в течение 40 минут, записывая как цитоплазматический сигнал GFP, так и ядерный сигнал mCherry. Затем ядра отслеживались, и их движение использовалось в качестве прокси для движения клеток. Треки, соответствующие полстеровым клеткам, были идентифицированы по их сильному сигналу GFP (рисунок 3A, фильм S1). Постоянство движения клеток измеряли путем вычисления автокорреляции направления ^{клеток24}. Сосредоточение внимания на полстеровых клетках, расположенных в передней половине полстера, показало, что разрыв полстера в его середине, таким образом отделяя эти клетки от задней части полстера, уменьшал автокорреляцию их направления (рисунок 3B), демонстрируя, что правильная миграция полстерных клеток требует целостности всего полстера в соответствии с его продемонстрированной коллективной ^{миграцией17}.

После приобретения постабляционной пленки эмбрионы можно демонтировать, осторожно извлекая их из агарозы с помощью мелких щипцов, и инкубировать при 28,5 °C до тех пор, пока они не достигнут 24 ч после оплодотворения. Опять же, эмбрионы должны выживать и не должны иметь какого-либо явного морфологического дефекта (рисунок 1C, D).

Фильм S1: Успешная лазерная абляция. Лазерная абляция в середине полстера эмбриона Tg(gsc:GFP), экспрессирующего Histone2B-mCherry. Ядра из передней части полстера отслеживаются с течением времени и отмечаются пурпурными точками. Треки имеют цветовую кодировку времени (рисунок 3). Пустые кадры соответствуют лазерной абляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Здесь мы описываем протокол, который использует нелинейную оптику для выполнения глубоких и пространственно четко определенных объемных абляций. Наиболее важным шагом протокола является поиск условий лечения, которые обеспечивают достаточную энергию, чтобы позволить абляцию, но не слишком много энергии, чтобы избежать чрезмерного мусора или кавитации. Количество доставляемой энергии в целевой участок в основном зависит от: (1) мощности выхода лазера, (2) качества лазерного выравнивания, (3) природы ткани, через которую проходит свет, чтобы достичь плоскости абляции, (4) глубины плоскости абляции. Поэтому перед каждым экспериментом крайне важно измерить мощность выхода лазера, настроить ее до эталонного значения (300 мВт при 820 нм в нашем протоколе) и обеспечить правильное лазерное выравнивание. Согласно этим предположениям, условия лечения должны быть воспроизводимыми от одного экспериментального дня к другому. Мы рекомендуем проводить обширные испытания для определения оптимальных параметров (мощность лазера и количество рамок обработки) для конкретного типа образца. Эти параметры затем могут быть использованы во всех подобных экспериментах. В описанном здесь примере (разрыв полстера во время гаструляции) мы, например, установили условия лечения абляций на разных глубинах внутри эмбриона (таблица 1) и теперь опираемся на эту диаграмму при выполнении экспериментов. Следует отметить, что длина волны 820 нм была выбрана, поскольку в нашей системе длина волны обеспечивает самые высокие пиковые энергии (из-за свойств лазера и оптики). Более короткие или более длинные волны могут быть использованы в зависимости от свойств системы6,11,12. Глубина целевой ткани является критическим параметром, монтаж эмбриона также является решающим шагом, так как неправильное крепление может увеличить толщину ткани, через которую должен пройти свет, чтобы достичь целевого объема.

Одной из первоначальных особенностей описываемого протокола является абляция целого объема путем выполнения последовательных абляций на разных фокальных плоскостях. Поскольку абляции будут генерировать обломки, которые поглощают свет, мы определили, что крайне важно начать абляцию на самой глубокой плоскости и последовательно удаляться из самой глубокой в самую поверхностную плоскость.

Этот протокол описывает абляцию глубоких и больших объемов и запись реакции соседних тканей в течение нескольких минут после абляции до более чем часа. Одним из потенциальных ограничений протокола является время, необходимое для выполнения абляции и перезапуска изображения. Эта задержка ограничена двумя факторами. Первый — это время, необходимое для выполнения абляций на нескольких фокальных плоскостях. На нашей системе разрыв полстера выполняется обученным пользователем за 2-3 мин. Это может быть уменьшено путем оптимизации программного обеспечения для автоматизации абляции на разных плоскостях. Тем не менее, общее время абляции будет равно времени, необходимому для сканирования целевой области, умноженному на количество повторений на каждой фокальной плоскости, умноженному на количество фокальных плоскостей, которое в наших условиях составляет около 1 мин. Учитывая скорость миграции клеток, это означает, что некоторые клетки могут входить или выходить из целевой области во время процедуры абляции. В нашем случае это не оказалось проблемой, но может быть, если требуется абсолютная точность в нацеливании на клетки. Второй ограничивающий фактор заключается в том, что один и тот же лазер используется для выполнения абляции (при 820 нм) и возбуждения зеленого флуорофора (при 920 нм). Таким образом, задержка между последней абляцией и началом записи определяется временем, необходимым для настройки лазера от 820 нм до 920 нм, в диапазоне от 30 с до 1 мин.

В некоторых случаях, в частности, для небольших абляций (одноклеточная абляция, абляция субклеточных компонентов, таких как элементы цитоскелета), регистрация немедленного ответа клетки/ткани может иметь решающее значение для вывода ее механического состояния25,26,27. В таких случаях ограничение может быть обойдено либо путем визуализации с помощью другого лазера (здесь, например, записи только красных сигналов с помощью лазера 1160 нм или с использованием третьей лазерной линии), либо путем визуализации зеленого флуорофора на 820 нм. Это не оптимальная длина волны для визуализации (ограниченное возбуждение флуорофоров, сильные фототоксические эффекты), но может использоваться в течение коротких периодов времени для регистрации немедленного ответа тканей.

Доступно несколько методов, чтобы устранить клетки и увидеть, как это влияет на остальную часть эмбриона. Двумя основными вариантами являются физическое удаление клеток или их уничтожение, как при лазерной абляции. По сравнению с физическим удалением, разрушение клеток может высвобождать цитоплазматическое содержимое, которое может влиять на соседние клетки. Это было исторически подчеркнуто противоречиями и расходящимися результатами, полученными Вильгельмом Ру и Гансом Дришем в отношении мозаичного или регулятивного развития эмбриона лягушки и морского ^ежа28. Совсем недавно наблюдались различия в анализах заживления ран, в зависимости от того, создается ли рана царапиной (которая разрушает некоторые клетки) или удалением ^{вставки29}. Однако физическое удаление клеток без повреждения других тканей возможно только для клеток на самой поверхности эмбриона и клеток, которые не слишком прилипают к своим соседям, тем самым ограничивая диапазон таких подходов. Следовательно, были разработаны различные стратегии для уничтожения клеток, причем лазерная абляция является наиболее используемой. УФ-лазерная абляция использовалась и все чаще используется, в частности, для выполнения небольших, поверхностных абляций и наблюдения за немедленной реакцией тканей.

Здесь мы описали использование инфракрасного света для выполнения более глубоких и пространственно четко определенных абляций. Основным ограничением этого протокола является потребность в инфракрасном импульсном лазере и двухфотонной настройке визуализации. Однако такое оборудование становится все более частым на платформах визуализации. Кроме того, EOM, используемый здесь для выборочного удаления одной области на изображении, может быть заменен модулем восстановления флуоресценции после фотоотбеливания (FRAP). Хотя это менее удобно, можно было бы даже выполнить протокол без модулей EOM или FRAP, просто увеличив масштаб целевой ^{области10}. Использование импульсного инфракрасного лазера дает два основных преимущества по сравнению с большинством классических протоколов абляции. Во-первых, благодаря эффективному проникновению инфракрасного света в живые ткани, глубокие фокальные плоскости могут быть достигнуты с помощью лазерных мощностей, которые не вызывают повреждений вне фокуса. Это позволило нам нацеливаться на клетки глубиной до 120 мкм, вне досягаемости с помощью однофотонных протоколов возбуждения. Во-вторых, использование нелинейной оптики обеспечивает отличное осевое разрешение, позволяя точно контролировать 3D-абляцию даже на глубине в ткани. Сочетание этих двух преимуществ позволяет абляцию специфически определенных, глубоких и, в конечном счете, больших объемов.

Мы описываем использование двухфотонного микроскопа для разрыва полстера, эксперимент, который мы и другие недавно ^{провели30}. Однако при незначительных корректировках предлагаемый протокол может быть адаптирован ко многим различным образцам. Мы, например, успешно использовали его для выполнения полной абляции полстера, абляций в боковой мезодерме во время гаструляции или абляций отдельных швановых клеток во время их миграции на связанный с ними аксон, не затрагивая аксон. Поэтому мы считаем, что этот протокол является ценным и универсальным инструментом, который должен быть полезен во многих экспериментальных системах для анализа влияния некоторых клеток / тканей на поведение и развитие соседних структур.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Мы благодарим Эмили Менант за уход за рыбами, Политехнический центр биовизуализации, в частности Пьера Маху, за помощь в создании живой визуализации на их оборудовании, частично поддерживаемом Région Ile-de-France (interDIM) и Национальным агентством исследований (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 France BioImaging). Эта работа была поддержана грантами ANR 15-CE13-0016-1, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016 и исследовательской и инновационной программой Европейского союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри No 840201, Министерства высшего и научного образования и Национального центра научных исследований.