Электрохимиотерапия при 3D сфероидах меланомы глаза с использованием индивидуального электрода

В данной работе мы представляем протокол разработки 3D сфероидов конъюнктивы и увеальной меланомы и использования ручных специализированных электродов для in vitro электрохимиотерапии 3D сфероидов в культуральной лунке. Это открывает новые перспективы в использовании электрохимиотерапии в лечении меланомы глаза.

Электрохимиотерапия (ЭСТ) представляет собой сочетание преходящего образования пор после применения электрического импульса с введением цитотоксических препаратов, что усиливает цитотоксическое действие применяемого средства за счет изменения мембраны. Системы 3D-культивирования in vitro моделируют рост опухоли in vivo и сохраняют биологические характеристики опухолей более точно, чем обычные монослойные клеточные культуры. Описан протокол разработки 3D опухолевых органоидов с использованием клеточных линий меланомы конъюнктивы (КМ) и увеальной меланомы (УМ), а также использование ручных специализированных электродов, пригодных для проведения ЭСТ in vitro в культуральной лунке без разрушения опухолевого окружения. В этом протоколе анализируется культивирование и рост сфероидов 3D CM и UM и их реакция только на блеомицин (2,5 мкг/мл), только электропорацию (ВП) (750 В/см, 8 импульсов, 100 мкс, 5 Гц) и ЭСТ в виде комбинации ВП и блеомицина. Концентрация препарата и настройки ВП, используемые в этом протоколе, были установлены в качестве предпочтительных условий ЭСТ в соответствии с предыдущими экспериментами. Анализ, используемый для определения жизнеспособности сфероидов, проводили через 3-7 дней после лечения. Влияние на жизнеспособность и рост сфероидов 3D опухоли было значимым только после ЭСТ. Индивидуальные электроды подробно описаны для того, чтобы облегчить применение импульсов в культуральной лунке. Этот новый метод лечения сфероидов 3D UM и CM закладывает основу для будущего клинического применения.

Увеальная меланома (УМ) является наиболее распространенной первичной внутриглазной опухолью у взрослых, в то время как меланома конъюнктивы (КМ) составляет 2% всех глазных меланом 1,2,3,4,5,6. Брахитерапия, лучевая терапия протонным пучком и фототерапия являются методами лечения первой линии при УМ, в то время как энуклеация глазного яблока может быть необходима ^1,2,3. Лечение КМ варьируется в зависимости от центра офтальмологической онкологии; Эксцизионная биопсия с последующей местной химиотерапией и/или лучевой терапией является наиболее частым подходом к лечению⁴. Несмотря на лечение, КМ связан со смертностью 25–30%⁵.

Существует небольшое количество литературы по формированию сфероидов КМ и УМ и применению ЭСТ при меланоме глаза ^6,7,8. Опухолевые сфероиды обладают лучшими биологическими особенностями, чем обычные 2D-клеточные культуры, и были предложены в качестве полезного инструмента для имитации опухолевой среды in vivo⁹. Электрохимиотерапия (ЭСТ) сочетает в себе применение непроницаемых цитотоксических препаратов с электропорацией (ЭП)¹⁰. ВП представляет собой местное применение коротких и интенсивных электрических импульсов, которые временно проникают в клетки, что приводит к локальному увеличению поглощения противораковых препаратов раковыми клетками и приводит к^{увеличению гибели клеток}. В этом исследовании разработан протокол, описывающий развитие сфероидов КМ и УМ, и исследуются результаты после ЭСТ с блеомицином. Этот протокол может помочь исследователям в области онкологии глаза в использовании других терапевтических методов на сфероидах или в изучении дальнейших эффектов ЭСТ. Из-за ограниченного использования ЭСТ в офтальмологии существует мало знаний о влиянии и процессе применения этого метода; Таким образом, этот эксперимент может расширить спектр вариантов лечения в будущем. Мы предлагаем новую индивидуальную настройку ручного пластинчатого электрода, которая позволяет проводить ЭСТ сфероида в культуральных лунках без разрушения опухолевой среды.

1. Формирование сфероида

1. Используйте слипшиеся растущие линии раковых клеток для формирования сфероидов.
2. Обеспечьте выполнение всех этапов, связанных с культивированием клеток, в условиях стерильного стенда.
3. Приготовьте стандартную полнокультуральную среду в соответствии с рекомендациями для представляющих интерес клеточных линий и нагрейте до 37 °C на водяной бане.
   Примечание: В данном случае были использованы и культивированы клеточные линии конъюнктивы человека CM2005.1, CRMM1, CRMM2, а также клеточные линии увеальной меланомы 92.1, OMM1 и OMM2 в среде Ham F-12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, соответственно.
4. Отделите интересующие клетки с помощью стандартных методов ферментативного расщепления (например, раствора трипсина-ЭДТА).
5. Чтобы определить количество жизненно важных клеток, суспендируйте 10 мкл клеточной суспензии в 10 мкл раствора трипанового синего (1:1) и подсчитайте клетки с помощью камеры (гемоцитометра или автоматического счетчика клеток) в течение 5 мин. Клетки должны быть <90% от места слияния и находиться в хорошем состоянии.
6. Для образования сфероидов высевают 5 х 10³ клеток в лунку общим объемом 200 мкл полной питательной среды в 96-луночные планшеты со сверхнизким присоединением. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5%_CO2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективного ингибирования клеточного прикрепления используйте пластины со сверхнизким уровнем прикрепления с ковалентно связанным гидрофильным, неионным, нейтрально заряженным гидрогелем на поверхности. Этот гидрогель ингибирует увековечение клеток и заставляет их находиться в подвешенном состоянии для создания 3D-сфероидов.
7. Проверьте сфероидное образование с помощью микроскопа.
   Примечание: Некоторые клеточные линии не образуют круглых трехмерных сфероидов опухоли при первом пассаже. Пройдите культуру опухолевой сферы до того, как в них начнет развиваться темный центр. Диссоциацию опухолевых масс в зависимости от клеточной линии проводят через 4-10 дней методом трипсинизации. После этого посейте одиночные клетки в свежую пластину со сверхнизким уровнем крепления 96. Повторив эту процедуру в течение нескольких пассажей, клетки адаптируются к 3D-культуре.

2. Электрохимиотерапия опухолевых сфероидов

1. В качестве контрольного анализа используйте необработанные сфероиды и сфероиды, обработанные только ВП или блеомицином.
2. Отрегулируйте настройки для электропоратора (количество импульсов, частоту импульсов, время и напряжение; см. Таблицу материалов). Для клеток меланомы используют 8 прямоугольных электрических импульсов силой 750 Вольт/см, длительностью импульса 100 мкс, частотой повторения 5 Гц.
3. На 3-е сутки посева сфероидов готовят свежий раствор сульфата блеомицина в стерильном PBS в концентрации 5 мкг/мл в пробирке объемом 15 мл.
4. Замените клеточную питательную среду сфероидов путем удаления 200 мкл питательной среды и повторного заполнения 100 мкл свежей полной питательной среды для каждой лунки.
5. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл раствора сульфата блеомицина (конечная концентрация 2,5 мкг/мл). Добавьте 100 мкл свежей среды к необработанным контрольным веществам и сфероидам, обработанным только ВП вместо раствора сульфата блеомицина.
6. Проведите электропорацию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Электроды, показанные на рисунке 1 , были изготовлены в исследовательской мастерской Университета Галле-Виттенберга. Они изготовлены из нержавеющей стали и подходят к рукоятке электропоратора. Электроды предназначены для использования в 96 луночных пластинах со сверхнизким прикреплением. Аналогичные электроды из нержавеющей стали могут быть легко изготовлены и для альтернативных применений.
   1. Простерилизуйте электроды с помощью этанола 70% и дайте электродам высохнуть. Диаметр электродов составляет 1 мм, зазор между двумя электродами — 4 мм, а длина каждого электрода — 8 мм (рис. 1а).
   2. Поместите электроды на дно лунки, а сфероиды между электродами. Это обеспечивает идеальное расположение сфероида между двумя электродами (Рисунок 1b).
   3. Встряхните пластину, чтобы сфероиды могли переместиться со дна лунки и поместиться между электродами. Сфероид будет находиться между электродами всего пару секунд.
   4. Запустите электропорацию с предпочтительными настройками.
   5. Замените раствор сульфата блеомицина в лунке, заменив 150 мкл среды на 150 мкл свежей среды.
   6. Инкубируйте клетки до 10 дней при 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5%_CO2. Если на необработанных сфероидах начинает развиваться темный центр, эксперимент следует прекратить. Обменивайте 150 мкл среды для культивирования клеток каждые 2-3 дня. Таким образом, чтобы избежать разрушения сфероида, расположите наконечник пипетки в краевой области лунки, наклоните планшет и медленно пипетируйте.

3. Определение размера сфероида

1. Измерьте размер сфероида в день лечения (начальная точка) и через 3-7 дней после лечения с помощью светлопольной микроскопии, рассчитав площадь поперечного сечения сфероидов с помощью ImageJ Fiji¹¹.
2. Сделайте изображение одиночных сфероидов с помощью масштабной линейки. Используйте увеличение, при котором будет виден весь сфероид. Например, для CM2005.1 использовалось 5-кратное увеличение. Сохраните изображение в формате JPEG.
3. Проанализируйте размер сфероида, рассчитав площадь поперечного сечения с помощью ImageJ/Fiji.
   1. Установите программное обеспечение (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   2. Запустите ImageJ/Fiji. Импортируйте spheroid-image: Файл > Открыть.
   3. Чтобы задать масштаб, нажмите кнопку с линией на панели инструментов и отметьте линию масштабной линейки на изображении щелчком мыши: Analyze > Set Scale. Используя известное расстояние, заполните расстояние масштабной линейки. Измените Единицу длины на μм. Щелкните глобальное поле, чтобы назначить настройки для всех изображений с одинаковым коэффициентом увеличения.
   4. Преобразовать изображение в 8-битное: Image > Type > 8-бит.
   5. Выберите Изображение > Настроить > Автоматический порог (Выберите > Не сбрасывать диапазон). Сфероид маркируется красным или черным цветом в зависимости от выбранного маркера порога. Отрегулируйте ползунки так, чтобы сфероидные пиксели становились красными, но несфероидные пиксели не меняли цвет. Закройте диалоговое окно Порог, не нажимая ни одну из кнопок.
   6. Чтобы рассчитать площадь поперечного сечения сфероида, выберите «Анализ» > «Задать измерения» и щелкните «Площадь», «Предел порога» и «Отобразить метку». Закройте диалоговое окно Задать измерения, нажав кнопку OK.
   7. Чтобы отобразить результаты, выберите «Анализ» > «Анализ частиц» и измените размер (μm²) = 10000-бесконечность, чтобы удалить шум. Нажмите кнопку Показать результаты и закройте окно, нажав OK. В поле Результаты отображаются сфероиды с меткой и площадью. Повторение анализов нескольких сфероидов позволяет получить результаты в окне «Результаты ».
   8. Чтобы определить относительную реакцию на лечение сфероидов, обработанных ЭСТ, по сравнению с контрольной группой, обработанной без лечения, и контрольной группы, проведите расчет процентных изменений площади поперечного сечения.

4. Определение жизнеспособности сфероида

1. Измерьте жизнеспособность сфероидов через 3-7 дней после обработки с помощью анализа жизнеспособности клеток, подходящего для 3D-клеточных культур в соответствии с инструкциями производителя. Анализ должен проникать и лизировать большие сфероиды, чтобы можно было обнаружить жизнеспособность путем количественного определения АТФ, которая сигнализирует о присутствии метаболически активных клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте в качестве метода считывания использовался анализ на основе люминесценции. Жизнеспособность сфероидов, обработанных ЭСТ, сравнивали с контрольной группой через семь дней после лечения.

Эксперименты проводились с использованием специальных ручных электродов, которые изготовлены из высококачественной нержавеющей стали. Толщина электродов составляет 1 мм, ширина – 4 мм, зазор между двумя электродами – 4 мм, а длина каждого электрода – 8 мм (рис. 1). ВП и блеомицин сами по себе не оказывают существенного влияния на жизнеспособность и рост сфероидов опухолей УМ и КМ. ЭСТ показывает значительное снижение жизнеспособности опухоли и размера сфероидов. После проведения ЭСТ с блеомицином наблюдалась потеря сфероидальной архитектуры с деконструированными фрагментами клеток вокруг сфероидов и некроз на центральной и периферической области всех исследуемых сфероидов. На рисунке 2 показаны результаты работы клеточных линий CM2005.1. Метастатические клеточные линии UM показали более высокий ответ по сравнению с первичными клеточными линиями после ЭСТ⁸.

Иллюстрация 1: Индивидуальные ручные электроды. Электроды изготовлены из высококачественной нержавеющей стали. Рукоятка электродов поставляется в комплекте с электропоратором. Толщина электродов – 1 мм, ширина – 4 мм, зазор между двумя электродами – 4 мм, длина каждого электрода – 8 мм (а); Электропорация сфероидов в формате 96 лунок (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Цитотоксическое действие электрохимиотерапии на опухолевые сфероиды клеточной линии меланомы конъюнктивы CM2005.1. Электрохимиотерапия (ЭСТ, 750 В/см после применения 2,5 мкг/мл блеомицина) вызывала более сильные цитотоксические эффекты у сфероидов по сравнению с только электропорацией (ВП) или химиотерапией с использованием только блеомицина (2,5 г/мл). Цитотоксический эффект измеряли путем расчета площади поперечного сечения и анализа жизнеспособности в процентах от необработанного контроля через семь дней после лечения. Ящичковые диаграммы показывают среднюю площадь поперечного сечения сфероидов (а); средняя жизнеспособность сфероидов (b); Репрезентативные изображения сфероидов, масштабная линейка = 200 μм (c). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

ВП используется в различных биотехнологических и клинических приложениях¹². Новые технологические разработки, такие как специально разработанные электроды с высокой специфичностью для каждой клетки-мишени и участка, могут помочь ЭСТ нацеливаться на ткани в любой^{точке тела}. Конструкция и расположение электродов должны обеспечивать полную доступность опухоли и гарантировать, что здоровые ткани будут затронуты или не будут повреждены в^{результате лечения.}

В предыдущих публикациях было показано влияние ЭСТ на суспензии клеток меланомы человека in vitro ^7,8. Литература, относящаяся к применению ЭСТ в 3D-моделях глазных клеток или других подобных средах in vivo, обеспечивающих более безопасное терапевтическое использование, ограничена. Brun et al. постулируют, что 3D-клетки в каркасе во время морфологического анализа имеют круглую форму, отличную от удлиненной формы, показанной в 2D-культурах, но чрезвычайно похожую на клетки из биопсии пациентов⁹. Уточнение настроек терапии и инструментов, используемых в 3D-культурах, может привести к оптимизации параметров ЭСТ, что позволяет применять более точный клинический подход⁹.

Мы описываем технологическое развитие, касающееся новых электродов для применения ЭСТ в 3D-клеточных культурах. Блеомицин является наиболее часто назначаемым цитотоксическим средством в комбинации с ЭСТ¹¹. Предыдущие исследования нашей группы показали, что применяемые настройки ВП (750 Вольт/см, 8 импульсов, 100 мс, 5 Гц) подходят для лечения опухолей глаза in vitro. Важнейшие этапы метода включают в себя короткое время, необходимое для выполнения ЭСТ, когда сфероид опускается после мобилизации, а также точный размер электродов. Необходимость в изготовлении электродов по индивидуальному заказу была связана со сложностями выполнения ЭСТ в скважинах с имеющимися инструментами. Неопубликованные данные нашей группы показали повышенное повреждение сфероидов при переносе сфероидов в большую лунку или в кювету для подготовки их к лечению, а затем обратно в культуральную лунку. Преимуществом описанной методики является отсутствие сфероидальных манипуляций для проведения лечения, поскольку органоиды не переносятся в более крупные пластины или лунки. Поэтому все сфероиды сохраняют свою форму. Еще одним преимуществом является использование более надежных 3D-анализов жизнеспособности для определения цитотоксичности ЭСТ по сравнению со стандартными анализами жизнеспособности, такими как анализ МТТ. Таким образом, все клетки сфероида лизируются, и требуется дополнительная промывка клеток, удаление среды и несколько этапов пипетирования.

Ограничениями описанных методов являются короткая продолжительность жизни сфероидов, что влияет на размер опухоли, а также на некроз клеток, наблюдаемый в центре опухолевого органоида. Связанная с этим высокая смертность как при КМ, так и при УМ и ограниченные терапевтические возможности требуют обогащения существующих терапевтических возможностей. ЭСТ может предложить адъювантный метод для улучшения качества жизни пациента и продления его выживаемости. Эти условия in vitro имитируют условия in vivo с более высокой точностью, предлагая многообещающие результаты для дальнейшего применения у человека. Будущие исследования с использованием сфероидов, полученных из первичных культур, могут дать более репрезентативные результаты для оптимизации настроек ЭСТ для таргетного лечения.

Этот отчет не получал специального гранта от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом или некоммерческом секторах.

Это исследование было поддержано доктором Рольфом М. Швите-Стифтунгом. Авторы благодарят Мартину Ягер (Лаборатория офтальмологии в LUMC, Лейден, Нидерланды) и Хелен Калирай (Ливерпульская исследовательская группа глазной онкологии, молекулярная и клиническая медицина рака, Университет Ливерпуля, Великобритания) за предоставление клеточных линий UM. Мы также хотели бы поблагодарить Сабину Хехт (отделение офтальмологии, университетская клиника Галле (Заале), Германия) за техническую помощь.