Method Article
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ספרואידים מלנומה תלת מימדיים של הלחמית והענבייה ושימוש באלקטרודות מותאמות אישית כף יד לאלקטרוכימותרפיה במבחנה של ספרואידים תלת מימדיים בבאר תרבית. זה מציע נקודות מבט חדשות בשימוש באלקטרוכימותרפיה בטיפול במלנומה עינית.
אלקטרוכימותרפיה (ECT) היא שילוב של היווצרות נקבוביות חולפת לאחר יישום פולס חשמלי עם מתן תרופות ציטוטוקסיות, מה שמשפר את ההשפעה הציטוטוקסית של החומר המיושם עקב שינויים בממברנה. מערכות תרבית תלת מימד במבחנה מדמות את צמיחת הגידול in vivo ושומרות על המאפיינים הביולוגיים של הגידולים בצורה מדויקת יותר מאשר תרביות תאים חד-שכבתיות קונבנציונליות. אנו מתארים פרוטוקול לפיתוח אורגנואידים תלת מימדיים של גידול באמצעות קווי תאי מלנומה של הלחמית (CM) ומלנומה ענבית (UM) וכן שימוש באלקטרודות מותאמות אישית ידניות, המתאימות ל-ECT במבחנה בתרבית היטב ללא הרס של סביבת הגידול. פרוטוקול זה מנתח את התרבית והצמיחה של ספרואידים תלת-ממדיים CM ו-UM ואת תגובתם לבלאומיצין (2.5 מיקרוגרם/מ"ל) בלבד, אלקטרופורציה (EP) (750 וולט/ס"מ, 8 פולסים, 100 מיקרון, 5 הרץ) לבד, ו-ECT כשילוב של EP ובלאומיצין. ריכוז התרופה והגדרות ה-EP המשמשות בפרוטוקול זה נקבעו כתנאי ECT מועדפים על פי ניסויים קודמים. הבדיקה ששימשה לקביעת כדאיות הכדור נערכה 3-7 ימים לאחר הטיפול. ההשפעה על הכדאיות והצמיחה של ספרואידים של גידול תלת מימד הייתה משמעותית רק לאחר ECT. האלקטרודות המותאמות אישית מתוארות בפירוט על מנת להקל על יישום פולסים בתרבית היטב. טיפול חדשני זה בספרואידים תלת מימדיים UM ו-CM מציב קרש קפיצה ליישום קליני עתידי.
מלנומה עגלגלית (UM) היא הגידול התוך עיני הראשוני השכיח ביותר בקרב מבוגרים, ואילו מלנומה של הלחמית (CM) מייצגת 2% מכלל המלנומות בעיניים 1,2,3,4,5,6. ברכיתרפיה, רדיותרפיה בקרן פרוטונים ופוטותרפיה הם טיפולי הקו הראשון ב-UM, בעוד שהסרת כדור הארץ עשויה להיות נחוצה 1,2,3. הטיפול ב-CM משתנה בין מרכזים אונקולוגיים של העין; ביופסיה כריתה ואחריה כימותרפיה מקומית ו/או טיפול בקרינה היא גישת הטיפול השכיחה ביותר4. למרות הטיפול, CM קשור לתמותה של 25%-30%5.
יש מחסור בספרות על היווצרות ספרואידים CM ו-UM ויישום ECT במלנומה עינית 6,7,8. לספרואידים של גידול יש תכונות ביולוגיות טובות יותר מאשר תרביות תאים דו-ממדיות קונבנציונליות והוצעו ככלי שימושי לחיקוי סביבת הגידול in vivo9. אלקטרוכימותרפיה (ECT) משלבת שימוש בתרופות ציטוטוקסיות שאינן חדירות עם אלקטרופורציה (EP)10. EP הוא יישום מקומי של פולסים חשמליים קצרים ואינטנסיביים המחלחלים באופן זמני לתאים לעלייה מקומית של ספיגת תרופות אנטי-סרטניות בתאים סרטניים וגורמת למוות מוגבר של תאים11. מחקר זה קובע פרוטוקול המתאר את התפתחותם של ספרואידים CM ו-UM וחוקר את התוצאות לאחר ECT עם בלאומיצין. פרוטוקול זה יכול לסייע לחוקרים בתחום אונקולוגיה של העיניים באמצעות שיטות טיפוליות אחרות על ספרואידים או לחקור השפעות נוספות של ECT. בשל השימוש המוגבל ב-ECT ברפואת עיניים, יש מעט ידע לגבי ההשפעה והתהליך של שיטה זו; לפיכך, ניסוי זה עשוי להרחיב את קשת אפשרויות הטיפול בעתיד. אנו מציעים הגדרת אלקטרודה ידנית מותאמת אישית חדשה, המאפשרת ECT של הספרואיד בבארות התרבות ללא כל הרס של סביבת הגידול.
1. היווצרות ספרואידים
2. אלקטרוכימותרפיה של ספרואידים הגידול
3. קביעת גודל הכדור
4. קביעת כדאיות הכדור
הניסויים נערכו עם אלקטרודות ידניות מותאמות אישית, המורכבות מפלדת אל-חלד בדרגה גבוהה. עובי האלקטרודות הוא 1 מ"מ, הרוחב הוא 4 מ"מ, המרווח בין שתי האלקטרודות הוא 4 מ"מ והאורך של כל אלקטרודה הוא 8 מ"מ (איור 1). ל-EP ולבלאומיצין לבדם אין השפעה משמעותית על הכדאיות והצמיחה של ספרואידים של גידול UM ו-CM. ECT מראה ירידה משמעותית בכדאיות הגידול ובגודל הספרואיד. אובדן ארכיטקטורת ספרואידים עם שברי תאים מפורקים סביב הספרואידים ונמק באזור המרכזי וההיקפי של כל הספרואידים שנבדקו נצפו לאחר ECT עם בלאומיצין. איור 2 מציג את התוצאות של שורות התאים CM2005.1. קווי תאי UM גרורתיים הראו תגובה גבוהה יותר בהשוואה לקווי תאים ראשוניים לאחר ECT8.
איור 1: אלקטרודות כף-יד מותאמות-במיוחד. האלקטרודות עשויות מפלדת אל חלד בדרגה גבוהה. ידית האלקטרודות מסופקת עם האלקטרופורטור. עובי האלקטרודות הוא 1 מ"מ, הרוחב הוא 4 מ"מ, הפער בין שתי האלקטרודות הוא 4 מ"מ ואורך כל אלקטרודה הוא 8 מ"מ (a); אלקטרופורציה של ספרואידים בפורמט של 96 בארות (B). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השפעה ציטוטוקסית של אלקטרוכימותרפיה על ספרואידים של גידול קו תאי מלנומה של הלחמית CM2005.1. אלקטרוכימותרפיה (ECT, 750 וולט/ס"מ לאחר מריחת 2.5 מיקרוגרם/מ"ל בלאומיצין) גרמה להשפעות ציטוטוקסיות חזקות יותר בספרואידים בהשוואה לאלקטרופורציה (EP) בלבד או כימותרפיה באמצעות בלאומיצין (2.5 גרם/מ"ל) בלבד. ההשפעה הציטוטוקסית נמדדה על ידי חישוב שטח החתך ובדיקת כדאיות כאחוז מהביקורת הלא מטופלת שבעה ימים לאחר הטיפול. תרשימי קופסאות מציגים את שטח החתך הממוצע של ספרואידים (a); הכדאיות הממוצעת של ספרואידים (B); תמונות מייצגות של ספרואידים, סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (C). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
EP משמש ביישומים ביוטכנולוגיים וקליניים שונים12. פיתוחים טכנולוגיים חדשים, כגון אלקטרודות שתוכננו במיוחד עם ספציפיות גבוהה לכל תא מטרה ואתר, עשויים לסייע ל-ECT למקד רקמות בכל מקום בגוף12. העיצוב והמיקום של האלקטרודות חייבים לאפשר נגישות מלאה לגידול ולהבטיח שרקמה בריאה תושפע רק באופן מינימלי או לא תיפגע מהטיפול13.
פרסומים קודמים הראו את ההשפעה של ECT על תרחיפי תאי מלנומה אנושיים במבחנה 7,8. הספרות המתייחסת ליישום ECT במודלים תלת מימדיים של תאי עיניים או סביבות דומות אחרות in vivo, המאפשרות שימוש טיפולי בטוח יותר, מוגבלת. ברון ועמיתיו מניחים כי לתאים התלת-ממדיים בפיגום במהלך הניתוח המורפולוגי יש צורה עגולה שונה מהצורה המוארכת המוצגת בתרביות הדו-ממדיות אך דומה מאוד לתאים מביופסיות של חולים9. חידוד הגדרות הטיפול והמכשירים המשמשים בתרביות תלת מימד עשוי להוביל לאופטימיזציה של פרמטרי ECT, מה שמאפשר גישה קלינית מדויקת יותר9.
אנו מתארים פיתוח טכנולוגי לגבי אלקטרודות חדשות ליישום ECT בתרביות תאים תלת מימדיות. בלאומיצין הוא החומר הציטוטוקסי הנפוץ ביותר בשילוב עם ECT11. מחקרים קודמים של קבוצתנו הראו כי הגדרות ה-EP המיושמות (750 וולט/ס"מ, 8 פולסים, 100 אלפיות השנייה, 5 הרץ) מתאימות לטיפול בגידולי עיניים במבחנה. השלבים הקריטיים של הטכניקה כוללים את הזמן הקצר הדרוש לביצוע ה-ECT בזמן שהספרואיד שוקע לאחר הגיוס, כמו גם את הממד המדויק של האלקטרודות. הצורך באלקטרודות המותאמות אישית נבע מקשיים בביצוע ECT בבארות עם המכשירים הזמינים. נתונים שלא פורסמו מהקבוצה שלנו הראו נזק מוגבר לספרואידים בעת העברת הספרואידים לבאר גדולה יותר או לקובט כדי להכין אותם לטיפול ואז בחזרה לבאר התרבית. יתרון בטכניקה המתוארת הוא היעדר מניפולציה ספרואידית לביצוע הטיפול, מכיוון שהאורגנואידים אינם מועברים לצלחות או בארות גדולות יותר. לכן, כל הספרואידים שומרים על צורתם. יתרון נוסף הוא השימוש במבחני כדאיות תלת מימדיים חזקים יותר לקביעת ציטוטוקסיות של ECT בהשוואה למבחני כדאיות סטנדרטיים, כגון בדיקת MTT. לפיכך, כל תאי הספרואיד עוברים ליזה ונדרשת שטיפת תאים נוספת, הסרת שלבי פיפטינג בינוניים ומרובים.
מגבלות השיטות המתוארות הן תוחלת החיים הקצרה של הספרואידים, המשפיעה על גודל הגידול כמו גם על נמק התאים, כפי שניתן לראות במרכז האורגנואיד של הגידול. שיעור התמותה הגבוה הנלווה הן ב-CM והן ב-UM והאפשרויות הטיפוליות המוגבלות מחייבים העשרת האפשרויות הטיפוליות הקיימות. ECT עשוי להציע שיטה מסייעת לשיפור איכות חייו של המטופל ולהאריך את הישרדותו של המטופל. תנאי מבחנה אלה מחקים סביבת in vivo עם דיוק גבוה יותר, ומציעים תוצאות מבטיחות ליישום אנושי נוסף. מחקרים עתידיים המשתמשים בספרואידים שהוכנו מתרביות ראשוניות יכולים לספק תוצאות מייצגות יותר לאופטימיזציה של הגדרות ECT לטיפול ממוקד.
דוח זה לא קיבל מענק ספציפי מסוכנות מימון כלשהי במגזר הציבורי, המסחרי או ללא מטרות רווח.
מחקר זה נתמך על ידי קרן ד"ר רולף מ. שווייטה. המחברים מודים למרטין ג'אגר (המעבדה לרפואת עיניים ב-LUMC, ליידן, הולנד) והלן קליראי (קבוצת המחקר לאונקולוגיה של העיניים בליברפול, רפואה מולקולרית וקלינית לסרטן, אוניברסיטת ליברפול, בריטניה) על אספקת קווי תאי ה-UM. ברצוננו גם להודות לסבין הכט (מחלקת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי האלה (זאלה), גרמניה) על הסיוע הטכני.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bleomycin sulfate | Enzo | BML-AP302-0010 | 10 mg |
Cell culture flask 75 cm | TPP | TPP90076 | |
Cell culture flask TC175 cm | Sarstedt | 83,39,12,002 | Standard with Filter |
Cliniporator | IGEA | EPS01 | Electroporator |
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 96 well, round bottom | Corning | 7007 | 96Well clear round Bottom, Ultra low attachment plates |
EGF 1MG | Sigma-Aldrich | E4127-.1MG | |
F-12 K Nut Mix (1x) | Gibco | 21127-022 | |
Fetal Bovine Serum, South American | Corning | 35-079-CV | LOT Nr. 35079010, Reservierungsnummer: EU00478541 |
FKS | |||
KGM-2 | Lonza | CC-3103 | |
PBS w/o. CaCl und MgCl | PromoCell | C-40232 | 500 ml |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ml | |
RPMI 1640 | Gibco | 11504566 | ATCC modification, HEPES, liquid, 500 ml |
Tecan Infinity M Plex | Tecan | ||
Trypsin-EDTA 1x Solution | Sigma-Aldrich | 59430C-100ml |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved
We use cookies to enhance your experience on our website.
By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.